甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的表达及其免疫保护性研究

论文摘要

伤寒是一种急性全身性感染，每年全球伤寒（包括副伤寒）患者约2200万，死亡超过20万人。伤寒包括伤寒沙门氏菌（Salmonella typhi）引起的伤寒和甲、乙、丙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi A，B and C）引起的副伤寒。近年来我国甲型副伤寒的发病率呈逐年上升趋势，研究出安全、高效、经济的疫苗，对于预防甲型副伤寒爆发具有重大的经济社会效益。甲型副伤寒沙门氏菌是无荚膜的革兰氏阴性菌，其外膜蛋白在致病和刺激机体免疫应答方面起着非常重要的作用。因此，在研究和开发疫苗中，病原体的外膜蛋白成为热点。本论文对甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的克隆表达及其免疫保护性进行了研究，目的在于探索应用甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白作为保护性抗原，获得甲型副伤寒候选疫苗的可能性。本课题选择毒力较强的甲型副伤寒沙门氏菌50973做为实验菌株，以NmpC、MipA、OmpW、PagC、OmpX、PomP（GI：56412276）、OmpC、FadL、TolC、BtuB和Imp等11个外膜蛋白为目标蛋白，分别将其基因的PCR扩增片段克隆到pET-32a表达载体，筛选出阳性克隆，用IPTG作为诱导剂，实现了这11种目标外膜蛋白的过量表达。利用这些过表达目标蛋白在盐溶液中形成沉淀而在水中可溶的特性实现了目标蛋白的有效分离。采用腹腔注射和体内攻毒的方法对纯化好的外膜蛋白的免疫保护性进行了研究，结果表明，PagC、OmpX、NmpC、FadL、TolC和BtuB等6个外膜蛋白具有良好的免疫保护力，其保护率分别为100％、100％、95％、75％、75％和70％。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 沙门氏菌的致病机理及其外膜蛋白分子免疫学研究进展
• 1.1 沙门氏菌的致病性
• 1.1.1 沙门氏菌对机体的侵袭过程及患者的临床特征
• 1.1.2 沙门氏菌的致病机理
• 1.2 外膜蛋白的组成、结构及功能
• 1.3 沙门氏菌外膜蛋白的同源性研究
• 1.4 沙门氏菌外膜蛋白在细菌致病中的作用
• 1.4.1 沙门氏菌外膜蛋白诱导巨噬细胞凋亡
• 1.4.2 沙门氏菌外膜蛋白作为毒力因子
• 1.4.3 伤寒沙门氏菌外膜蛋白诱发反应性关节炎
• 1.5 沙门氏菌外膜蛋白在细菌抗药性中的作用
• 1.5.1 沙门氏菌外膜蛋白与细菌耐药性的相关性
• 1.5.2 乳铁蛋白增强抗生素的抑菌效应
• 1.6 沙门氏菌外膜蛋白的免疫学特性
• 1.7 沙门氏菌外膜蛋白在实验诊断学方面的研究与应用
• 1.8 展望
• 1.9 参考文献
• 第二章 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的表达
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 仪器设备及试剂
• 2.2.3 培养基配制
• 2.2.4 试剂配制
• 2.2.5 实验方法
• 2.2.5.1 表达载体的选择
• 2.2.5.2 引物设计及PCR扩增
• 2.2.5.3 PCR产物的纯化
• 2.2.5.4 质粒提取
• 2.2.5.5 酶切及酶切产物的纯化
• 2.2.5.6 连接
• 2.2.5.7 转化
• 2.2.5.8 转化质粒的提取
• 2.2.5.9 酶切质粒鉴定插入片段大小
• 2.2.5.10 PCR检测
• 2.2.5.11 测序
• 2.2.5.12 DNA序列分析
• 2.2.5.13 空质粒及重组质粒的转化
• 2.2.5.14 目标蛋白的诱导表达
• 2.2.5.15 蛋白表达情况的研究
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 PCR扩增结果
• 2.3.2 PCR回收结果
• 2.3.3 目的片段的酶切及酶切产物的回收定量结果
• 2.3.4 质粒的提取、酶切及回收定量结果
• 2.3.5 阳性克隆子初步筛选的实验结果
• 2.3.6 DNA序列测定结果
• 2.3.7 目标蛋白诱导表达条件的优化
• 2.3.7.1 融合蛋白TrxA-NmpC和TrxA-MipA诱导表达条件的优化
• 2.3.7.2 融合蛋白TrxA-OmpW诱导表达条件的优化
• 2.3.7.3 融合蛋白TrxA-PagC和TrxA-OmpX诱导表达条件的优化
• 2.3.7.4 融合蛋白TrxA-PomP、TrxA-OmpC、TrxA-FadL、TrxA-TolC、TrxA-BtuB和TrxA-Imp诱导表达条件的优化
• 2.3.8 讨论
• 2.4 参考文献
• 第三章 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白的纯化
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 仪器设备及试剂
• 3.2.3 培养基的配制
• 3.2.4 溶液的配制
• 3.2.5 目标蛋白的诱导表达及纯化
• 3.2.6 硫氧还蛋白的诱导表达及纯化
• 3.2.7 纯化蛋白的透析浓缩
• 3.2.8 质谱鉴定
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 实验结果
• 3.3.3.1 TrxA-NmpC和TrxA-MipA蛋白表达情况摸索
• 3.3.3.2 TrxA蛋白纯化结果
• 3.3.3.3 TrxA-OmpW、TrxA-PagC及TrxA-OmpX蛋白纯化结果
• 3.3.3.4 TrxA-NmpC和TrxA-MipA蛋白纯化结果;TrxA-NmpC泳道上质谱取点情况
• 3.3.3.5 TrxA-PomP、TrxA-OmpC、TrxA-FadL、TrxA-TolC、TrxA-BtuB及TrxA-Imp蛋白纯化结果;TrxA-FadL泳道上质谱取点情况
• 3.3.2 质谱鉴定结果
• 3.3.3 讨论
• 3.4 参考文献
• 第四章 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白免疫原性及免疫保护性研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 仪器设备及试剂
• 4.2.3 培养基的配制
• 4.2.4 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白免疫原性及免疫保护性研究
• 4.2.4.1 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白浓度的测定
• 4.2.4.2 免疫实验
• 4.2.4.3 攻毒实验
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 甲型副伤寒沙门氏菌外膜蛋白浓度的测定
• 4.3.2 BALB/c小鼠攻毒试验
• 4.3.2.1 第一批小鼠攻毒试验
• 4.3.2.2 第二批小鼠攻毒试验
• 4.3.3 讨论
• 4.4 参考文献
• 第五章 结论与建议
• 5.1 结论
• 5.2 建议
• 致谢
• 附录A1 仪器设备
• 附录A2 试剂
• 附录B pET-32a质粒图谱
• 附录C DNA测序结果
• 个人介绍
• 攻读学位期间的研究成果