一株新的纳他霉素生产菌L10的系统发育分析及其基因工程高产菌构建

论文摘要

纳他霉素是一种高效、安全的新型生物防腐剂,广泛应用于食品和制药领域,至今没有报道过抗药性。因此纳他霉素有十分广阔的市场和应用前景。目前发现能产生纳他霉素的链霉菌主要为纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)、褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)和恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)。本论文采用链霉菌多相分类原则,通过形态特征、生理生化特性、16S rDNA和RNA聚合酶β亚基编码基因rpoB序列的比较等方法对一株新分离的纳他霉素生产菌株L10进行分类鉴定,结果发现菌株L10与恰塔努加链霉菌最为相似,但孢子丝形态、使牛奶凝固和明胶液化的能力及对棉子糖的利用等方面存在差异,因此将其鉴定为恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanoogensis)的一个新的变种恰塔努加链霉菌L10。基于16S rDNA和rpoB基因构建的系统发育树,分析了已发现的几种纳他霉素生产菌系统发育地位,发现纳塔尔链霉菌和褐黄孢链霉菌在进化关系上十分相近,而恰塔努加链霉菌则与利迪链霉菌的16S rDNA相似度最高。抗生素工业菌种的改良多采用传统的辐射和化学诱变方法,然后对突变株进行筛选,也有采用基因组重排等技术,然后进行发酵培养基和条件的优化,但传统的菌种改良方法是一种随机诱变筛选操作过程,具体机制不清楚,工作量比较大,多轮的诱变和筛选后,再提高菌株的发酵水平就变得十分困难。随着链霉菌基因组学和遗传操作体系的发展,链霉菌中部分次生代谢产物的合成和调控机制也逐渐被阐明,可以通过基因改造直接从基因水平调控放线菌的生物效价。本课题采用基因工程方法,成功构建了恰塔努加链霉菌L10的全基因组柯斯质粒文库,通过同源比对、文库筛选和引物步移等方法克隆到了恰塔努加链霉菌L10中纳他霉素生物合成的部分基因簇及其潜在的正调控基因ScNRⅡ和ScNRⅠ(近似全长),同时还克隆了ScNRⅡ在褐黄孢链霉菌中的同源基因SgNRⅡ。本课题还构建了ScNRⅡ基因多拷贝菌株恰塔努加链霉菌D1,摇瓶发酵发现在YSG培养基中D1的纳他霉素产量是出发菌株的3.3倍,同时对一株纳他霉素工业生产菌株进行相似基因工程改造后也使其纳他霉素产量上升了22%,达到5.7g/L,表明通过基因工程构建高产菌株是一种快速有效的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 链霉菌分类的研究进展
• 1.2.1 数值分类
• 1.2.2 化学分类
• 1.2.3 生化检测在链霉菌分类中的应用
• 1.2.4 基因型方法确定关联性
• 1.2.5 核酸序列比较
• 1.3 链霉菌次级代谢产物的生物合成
• 1.3.1 NRPS
• 1.3.2 PKS
• 1.4 链霉菌次级代谢调控
• 1.4.1 小分子效应物
• 1.4.2 双组分信号转导系统
• 1.4.3 途径专一性调控基因
• 1.5 基因工程方法在微生物菌种改良中的应用
• 1.5.1 代谢工程
• 1.5.2 调控基因
• 1.5.3 DNA shuffing
• 1.5.4 异源表达
• 1.5.5 基因组学对新药开发的影响
• 1.6 参考文献
• 第2章 菌株L10的鉴定及系统发育分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 菌株及其培养
• 2.2.2 溶液
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 仪器和设备
• 2.2.5 链霉菌基因组提取
• 2.2.6 PCR扩增
• 2.2.7 PCR产物测序及系统进化树构建
• 2.2.8 菌株的培养特征及形态特征
• 2.2.9 菌株的生理生化特性检测
• 2.3 结果和分析
• 2.3.1 形态特征
• 2.3.2 培养特征
• 2.3.3 生理生化特征
• 2.3.4 16S rRNA基因和rpoB基因的PCR扩增及序列测定
• 2.3.5 系统进化树构建
• 2.3.6 菌株L10和邻近链霉菌菌株的形态与生理生化特性比较
• 2.3.7 菌株L10的定名
• 2.4 讨论与小结
• 2.5 参考文献
• 第3章 恰塔努加链霉菌L10基因组柯斯质粒文库的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 S.chattanoogensis L10孢子悬液制备
• 3.2.4 S.chattanoogensis L10基因组的大量提取
• 3.2.5 部分酶切条件的建立
• 3.2.6 大规模制备部分酶切的基因组 DNA
• 3.2.7 Cosmid载体的准备
• 3.2.8 文库构建连接体系的建立
• 3.2.9 连接混合物的包装
• 3.2.10 转染感受态细胞制备
• 3.2.11 文库转染
• 3.2.12 柯斯质粒基因组文库质量检测
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 高分子量基因组DNA提取及部分酶切条件建立
• 3.3.2 Cosmid（pHAQ31）的处理
• 3.3.3 连接、包装和转染
• 3.3.4 文库质量检测与保存
• 3.4 讨论与小结
• 3.5 参考文献
• 第4章 应用基因工程方法构建纳他霉素高产菌研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 质粒
• 4.2.3 培养基
• 4.2.4 抗生素
• 4.2.5 酶和生化试剂
• 4.2.6 大肠杆菌质粒小量提取
• 4.2.7 E.coli的Ca2+法感受态细胞的制备及转化
• 4.2.8 链霉菌基因组DNA少量抽提
• 4.2.9 大肠杆菌与恰塔努加链霉菌L10的接合转移操作流程
• 4.2.10 生产曲线的测量
• 4.2.11 发酵液中Natamycin含量测定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 恰塔努加链霉菌L10（Streptomyces chattanoogensis L10）中纳他霉素生物合成正调控因子基因的克隆
• 4.3.2 通过基因工程提高恰塔努加链霉菌的纳他霉素产量
• 4.4 讨论与小结
• 4.5 参考文献
• 结论与展望
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢