SARS冠状病毒全基因测定、结构蛋白基因克隆、表达及相关研究

论文摘要

严重急性呼吸道综合征（SARS）是一种新现的主要经呼吸道传播的严重传染病,它的疾病特点很多还不为人知。我们利用分子生物学的方法,研究SARS冠状病毒（SARS-CoV）对不同组织的感染情况,并了解SARS流行初期病毒株的基因组序列。从感染SARS病毒而死亡的3例早期患者的不同组织中,用TRIzol RNA抽提试剂提取总RNA,并逆转录为cDNA,然后用SARS-CoV不同基因区间的特定引物进行PCR扩增,对其中1例患者肺组织中病毒株的全序列进行了测定。结果显示有2例患者仅在肺组织中扩增到病毒序列,另1例患者除在肺组织中检测到病毒外,还在气管、肾、淋巴结及肝组织中检测到了病毒的存在。研究结果进一步说明SARS-CoV具有多组织嗜性,这对研究SARS-CoV感染机体细胞的受体提供线索。病毒全序列分析结果显示,该序列全长为29 760碱基,具有典型的冠状病毒序列特征,除具有RNA聚合酶基因和S、E、M和N四种结构蛋白基因外,还有另外8个蛋白编码框。经与GenBank上登录的其它SARS-CoV全序列进行比对,发现该序列除存在少量的SNP外,还多出一段29个核苷酸序列,这段序列的存在完全改变了ORF10和ORF11两个蛋白编码框,使得在此终止的蛋白翻译能够继续进行下去,从而使ORF10和ORF11两个读框合成为一个读框。这一结果可能提示该序列有可能是病毒从动物传到人的原始序列。 为了充分认识SARS的本质,获得更多关于SARS-CoV的免疫致病机理的信息,我室开始构建SARS-CoV主要结构蛋白原核表达载体,并探讨各结构蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达情况及其抗原性。从SARS病人组织中抽提出RNA,经RT-PCR获得了SARS冠状病毒刺突蛋白（S）、核衣壳蛋白（N）和膜蛋白（M）基因,将S基因的两个区段、N基因和M基因分别克隆至表达载体pET-32和pET-28上,转化大肠杆菌BL21,利用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况,并通过WB鉴定表达蛋白的抗原性。结果我们成功构建了SARS-CoV重组

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 SARS冠状病毒的多组织嗜性及其全基因序列的测定
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 SARS冠状病毒结构蛋白在大肠杆菌中的表达
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分 SARS恢复期患者特异性IgG抗体滴度观察与分析
• 材料
• 方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 论文撰写
• 致谢
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