雅致放射毛霉转化腺嘌呤合成ATP的研究

论文摘要

ATP是生物细胞生命活动能量的直接来源,临床上广泛用作细胞激活剂,对肝炎、心脏病、肌肉萎缩、脑溢血后遗症等有良好疗效,近期ATP促进细胞坏死和凋亡、抗癌等作用受到关注,有望成为抗癌辅助药物。本论文对毛霉菌转化腺嘌呤合成ATP进行了系统研究,包括响应面法优化毛霉菌培养条件及培养基、腺嘌呤合成ATP的初始反应体系的研究、菌体通透性的系统研究及补料反应体系初探。通过单因素试验得到毛霉菌最适培养温度为28℃,最佳摇床转速为160r/min,最佳培养时间为12h。通过单因素试验、Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验及Box-Behnken试验确定了毛霉菌的最适培养基（g/L）：葡萄糖51.54,酵母膏5.22,玉米浆14.31,MgSO4·7H2O0.5,FeSO4·7H2O0.1,NH4Cl3,K2HPO4·3H2O3,pH6.0～6.5。毛霉生物量、腺嘌呤转化率、ATP产量分别由优化前的23.51g/L、53.59%、6.56g/L提高至31.13g/L、59.97%、7.34g/L,分别提高32.41%、11.89%、11.89%。综合研究腺嘌呤合成ATP的初始反应体系,设计正交试验优化反应液配方,工艺改进后,在含有3g/L腺嘌呤的反应液中,经33℃转化反应12h, ATP产量达到8.51g/L,腺嘌呤转化率达到69.53%,与工艺改进前相比,提高了41.83%。利用物理方法、化学方法处理毛霉菌体,筛选出干燥方法并进行优化研究,采用电导率法验证干燥方法提高了毛霉菌细胞膜的通透性、腺嘌呤转化率及ATP产量。工艺优化后,ATP产量提高至10.13g/L,腺嘌呤转化率为82.76%,比对照组提高202.39%。通过单因素试验得出反应过程中最适pH为6.5,采用菲林试剂法测得葡萄糖最适浓度为40g/L,采用磷钒钼黄比色法测定Na2HPO4·12H2O浓度,建立磷标准曲线,得到Na2HPO4·12H2O最适浓度为20g/L,采用EDTA络合滴定法测得MgCl2·6H2O的最适浓度为3g/L。初步探索了毛霉菌转化腺嘌呤合成ATP的补料反应体系,结果表明：当腺嘌呤用量为8g/L时,腺嘌呤转化率为56.07%,ATP产量达到18.33g/L,比工艺优化前提高了179.42%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 符号与缩略语
• 第一章 文献综述
• 1.1 ATP概述
• 1.2 生物法合成ATP的反应机理
• 1.2.1 酵母菌转化腺苷合成ATP的机理
• 1.2.2 产氨短杆菌转化腺嘌呤合成ATP的机理
• 1.3 生物法合成ATP的研究进展
• 1.3.1 微生物发酵法
• 1.3.2 微生物酶系合成法
• 1.3.3 构建基因工程菌法
• 1.3.4 ATP生物合成法的比较
• 1.4 ATP分析测定方法
• 1.4.1 纸电泳法
• 1.4.2 纸层析法
• 1.4.3 琼脂糖凝胶电泳法
• 1.4.4 高效液相色谱法
• 1.4.5 ATP分析测定方法的比较
• 1.5 ATP分离提取方法
• 1.5.1 重金属沉淀法
• 1.5.2 离子交换法
• 1.5.3 ATP分离提取方法的比较
• 1.6 ATP的应用
• 1.6.1 医药方面
• 1.6.2 环境保护方面
• 1.6.3 微生物检验方面
• 1.7 前景与展望
• 1.8 选题意义、技术路线、研究内容及目标
• 1.8.1 选题意义
• 1.8.2 技术路线
• 1.8.3 研究内容
• 1.8.4 研究目标
• 参考文献
• 第二章 响应面法优化毛霉菌培养条件及培养基
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 药品与仪器
• 2.2.2 菌种
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 菌体培养、收集及称重
• 2.2.5 转化反应
• 2.2.6 产物分析及计算
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 温度对菌体培养的影响
• 2.3.2 摇床转速对菌体培养的影响
• 2.3.3 培养时间对菌体培养的影响
• 2.3.4 碳源种类的筛选
• 2.3.5 氮源种类的筛选
• 2.3.6 Plackett-Burman试验设计
• 2.3.7 最陡爬坡试验
• 2.3.8 响应面优化菌体培养基
• 2.3.9 响应面交互作用分析与优化
• 2.3.10 验证试验
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 腺嘌呤合成ATP的初始反应体系的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 药品、仪器、菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 菌体培养及收集、转化反应、产物分析及计算
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 反应温度对ATP产量的影响
• 3.3.2 初始反应pH对ATP产量的影响
• 3.3.3 反应时间对ATP产量的影响
• 3.3.4 磷酸盐种类的筛选
• 2HPO₄·12H₂O用量对ATP产量的影响'>3.3.5 Na₂HPO₄·12H₂O用量对ATP产量的影响
• 3.3.6 镁盐、锰盐种类的筛选
• 2·6H₂O用量对ATP产量的影响'>3.3.7 MgCl₂·6H₂O用量对ATP产量的影响
• 2·4H₂O用量对ATP产量的影响'>3.3.8 MnCl₂·4H₂O用量对ATP产量的影响
• 3.3.9 二甲苯加入时间对ATP产量的影响
• 3.3.10 反应液静置时间对转化反应的影响
• 3.3.11 正交试验优化反应液配方
• 3.3.12 验证试验
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 菌体通透性对腺嘌呤合成ATP的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 药品与仪器
• 4.2.2 菌种、培养基、菌体培养及收集
• 4.2.3 转化反应
• 4.2.4 产物分析及计算
• 4.2.5 物理方法的筛选
• 4.2.6 化学方法的筛选
• 4.2.7 电导率法考察菌体通透性
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 物理方法的筛选
• 4.3.2 化学方法的筛选
• 4.3.3 电导率法考察菌体通透性
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 腺嘌呤合成ATP的补料反应体系初探
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 药品与仪器、菌种、培养基、菌体培养
• 5.2.2 菌体收集及干燥处理
• 5.2.3 转化反应
• 5.2.4 产物分析及计算
• 5.2.5 葡萄糖含量的测定
• 2HPO₄·12H₂O含量的测定'>5.2.6 Na₂HPO₄·12H₂O含量的测定
• 2·6H₂O含量的测定'>5.2.7 MgCl₂·6H₂O含量的测定
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 菌体含水量的初步研究
• 5.3.2 菌体用量对转化反应的影响
• 5.3.3 最适反应pH的确定
• 5.3.4 葡萄糖最适浓度的确定
• 2HPO₄·12H₂O对转化反应的影响'>5.3.5 分批加入Na₂HPO₄·12H₂O对转化反应的影响
• 5.3.6 磷标准曲线的制作
• 2HPO₄·12H₂O最适浓度的确定'>5.3.7 Na₂HPO₄·12H₂O最适浓度的确定
• 2·6H₂O最适浓度的确定'>5.3.8 MgCl₂·6H₂O最适浓度的确定
• 5.3.9 补料反应体系初探
• 5.3.10 腺嘌呤用量对转化反应的影响
• 5.4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 致谢
• 攻读硕士学位期间主要科研成果