拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究

论文摘要

植物的各种器官、组织以及悬浮培养的细胞和原生质体均可诱导形成类似合子胚的结构,但它们与合子胚起源不同,称为胚状体(Embryoid)。由体细胞发生的胚状体称为体细胞胚(Somatic Embryo,SE)。体细胞胚胎发生是植物发育过程中的特殊现象,并在一定程度上重现了合子胚形态发生的特性,是植物细胞潜能完全表达的一种方式。因此,研究体细胞胚胎发生与发育的机理对于揭示细胞全能性与研究合子胚的分化和发育具有重要意义。本论文着重研究了拟南芥体细胞胚胎发生和发育的分子基础,研究结果为理解体细胞胚胎发生的分子机理提供了重要信息。主要研究结果如下:1.体细胞胚胎发生体细胞胚的产生首先需要胚性愈伤组织的形成,这个过程是在外源生长素的作用下完成的。除去外源生长素,在愈伤组织表面诱导形成突起状的体细胞原胚,然后体细胞原胚两侧产生子叶原基,最终形成具有两片子叶、胚轴和胚根的成熟体细胞胚。2.胚特征基因的表达通过胚特征基因LEC1, LEC2, FUS3, PEI1和ABI3的表达模式分析,发现它们的表达去除激素的体细胞胚诱导阶段表达明显上调。利用GUS报告基因对LEC2基因的表达进行了分析,结果显示它在体细胞原胚形成的早期开始表达,以后集中在子叶原基和子叶中表达。说明在体细胞胚再生过程中,胚特征基因的表达受到调节。3.WUS和CLV3基因的表达为了研究体细胞胚胎发生和发育过程中干细胞的起始,我们对WUS和CLV3的表达模式进行了分析。研究结果显示,体细胞胚发生早期,在胚性愈伤组织表面4～6层细胞(组织中心)中首先检测到WUS基因的表达。然后在新形成的体细胞原胚表面1～3层细胞中出现干细胞特征基因CLV3的表达,并在此位置形成体细胞原胚的突起状结构。体细胞胚发育过程中,两基因的表达均逐渐集中在子叶之间的苗端分生组织中。诱导反义WUS基因表达,体细胞胚的产生受到抑制,胚发育基因的表达也受到影响。表明在体细胞胚发生过程中,组织中心的细胞先于干细胞形成,WUS在此过程中起关键作用。4.生长素极性运输及分布体细胞胚胎发生需要生长素诱导。生长素在体细胞胚胎发生过程中呈极性分布。如果在诱导过程中添加生长素极性运输抑制剂NPA,不仅破坏了生长素的极性分布,还影响了WUS的表达,最终不能产生体细胞胚。生长素外运蛋白PIN1在体细胞胚发生过程中呈极性定位。体细胞胚胎发生早期,PIN1在即将产生体细胞原胚的位置表达。共定位分析显示,PIN1与WUS的表达区域在体细胞胚胎发生早期部分重叠,而在发育后期分离,即PIN1向着即将产生子叶的部分集中,而WUS则集中于子叶之间的苗端分生组织。因此,生长素极性运输及分布亦影响体细胞胚胎发生。5.不同浓度生长素的作用能够诱导体细胞胚产生的生长素浓度具有一定的范围。如果我们在诱导阶段施加过高和过低浓度的生长素,均不能诱导产生体细胞胚,并且也不能诱导其他器官的产生,只能形成不同形态的愈伤组织。而在不施加生长素的情况下,只是初级体细胞胚的继续发育,产生更多的叶和根。进一步的研究观察到在过高或过低浓度的生长素条件下,生长素极性的重新分布难以发生,并且WUS的表达模式亦受到影响。说明生长素极性分布的重新建立和组织中心的形成受生长素浓度的调节。本研究结果表明,在体细胞胚的发生和发育过程中,生长素的极性运输和组织中心细胞与干细胞的形成起关键作用,它们通过启动胚特征基因表达,最终决定体细胞原胚的产生,进而继续发育形成成熟体细胞胚。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 植物胚胎发育过程
• 1.1.1 合子极性的建立
• 1.1.2 顶细胞的发育及胚体的形成
• 1.1.3 基细胞的发育
• 1.2 植物胚胎发育的分子调控
• 1.2.1 胚胎发生早期极性建立过程中的基因表达调控
• 1.2.2 生长素的流动与胚胎轴向结构的形成
• 1.2.3 胚胎区域形态建立过程中的基因表达调控
• 1.2.4 胚的顶部区域的形态建成
• 1.2.4.1 定义中心和外围区域的基因
• 1.2.4.2 左右对称性的转变及子叶的出现
• 1.2.5 苗端分生组织的胚性起始
• 1.2.6 胚的基部区域的形态建成和根端分生组织的起始
• 1.2.6.1 胚轴的形成
• 1.2.6.2 胚根的形成和根的分生组织的起始
• 1.3 植物体细胞胚胎发生及研究进展
• 1.3.1 植物体细胞胚胎发生的意义
• 1.3.2 植物体细胞胚胎发生的研究基础
• 1.3.3 拟南芥中已经建立的体细胞胚胎发生系统
• 1.3.3.1 压力诱导体细胞胚胎发生系统
• 1.3.3.2 以未成熟合子胚做外植体诱导体细胞胚胎发生
• 1.4 植物体细胞胚胎发生的细胞生物学研究
• 1.4.1 体细胞胚胎发生的起源
• 1.4.2 体细胞胚胎极性的建立
• 1.5 激素信号转导与体细胞胚胎发生
• 1.6 体细胞胚胎发生与胚发育基因的表达
• 1.6.1 自培养的胚性组织中分离得到的基因和蛋白
• 1.6.2 利用胚胎缺陷型突变体分离得到的基因
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料及生长条件
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶及生化试剂
• 2.1.4 PCR 引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 拟南芥组织培养
• 2.2.1.1 胚性愈伤组织的培养
• 2.2.1.2 体细胞胚的诱导
• 2.2.2 表达载体的构建
• 2.2.2.1 植物组织总RNA 的提取
• 2.2.2.2 反转录cDNA 第一链的合成
• 2.2.2.3 植物基因组DNA 的提取及纯化
• 2.2.2.4 PCR 扩增
• 2.2.2.5 连接反应
• 2.2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的制备、转化及碱法小量质粒DNA 的提取
• 2.2.2.7 质粒DNA 的酶切鉴定
• 2.2.2.8 DNA 序列测定
• 2.2.2.9 诱导型anti-WUS 表达载体的构建
• 2.2.2.10 诱导型anti-PIN1 表达载体的构建
• 2.2.2.11 WUS::GUS 表达载体的构建
• 2.2.3 农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 2.2.3.1 根癌农杆菌GV3101 感受态细胞的制备与转化
• 2.2.3.2 拟南芥的栽培、转化及转基因植株分析
• 2.2.4 半定量RT-PCR 分析
• 2.2.4.1 胚胎发育过程中的基因在不同组织中的表达分析
• 2.2.4.2 生长素信号转导途径的基因在不同组织中的表达分析
• 2.2.5 原位杂交分析
• 2.2.5.1 材料的固定
• 2.2.5.2 材料的包埋
• 2.2.5.3 切片
• 2.2.5.4 探针标记
• 2.2.5.5 脱蜡、消化、乙酰化和杂交
• 2.2.5.6 洗片
• 2.2.5.7 检测
• 2.2.6 GUS 染色分析
• 2.2.7 GUS 染色后的石蜡切片
• 2.2.7.1 取材固定
• 2.2.7.2 脱水、透明、浸蜡、包埋
• 2.2.7.3 钌红染色
• 2.2.8 扫描电镜观察
• 2.2.9 共聚焦显微镜观察和图像处理
• 2.2.10 microRNA 芯片分析
• 3 结果与分析
• 3.1 体细胞胚胎发生系统的建立
• 3.1.1 体细胞胚的形态学观察
• 3.1.2 体细胞胚的扫描电镜观察
• 3.2 胚胎发育过程中基因的表达分析
• 3.2.1 胚胎发育过程中基因的半定量RT-PCR 分析
• 3.2.2 胚胎特征基因LEC2 在体细胞胚发生过程中的表达分析
• 3.3 干细胞决定基因在体细胞胚诱导过程中的表达分析
• 3.3.1 干细胞标记基因CLV3 的表达模式分析
• 3.3.2 组织中心标记基因WUS 的表达模式分析
• 3.3.3 CLV3 和WUS 基因在愈伤组织中的表达共定位
• 3.3.4 WUS 基因反义表达的作用
• 3.3.5 生长素运输抑制剂对WUS 基因表达模式的影响
• 3.4 生长素极性运输及分布
• 3.4.1 生长素的极性分布
• 3.4.2 PIN1 蛋白的极性定位
• 3.4.3 PIN1 蛋白与WUS 基因的共定位
• 3.5 不同浓度生长素的诱导作用
• 3.5.1 形态学观察
• 3.5.2 生长素的极性分布及WUS 基因的表达
• 3.6 MICRORNA 与体细胞胚胎发生
• 4 讨论
• 4.1 苗端分生组织的重新建成是体细胞胚发生的前提
• 4.2 组织中心的形成对于体细胞胚的诱导是必需的
• 4.3 生长素极性运输诱导体细胞胚胎发生
• 4.4 WUS 的表达需要一定水平的外源生长素诱导
• 4.5 生长素调节体细胞胚胎发生的初步模型的提出
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间完成的学术论文
• 致谢