检测MGMT启动子甲基化在肿瘤烷化剂个体化治疗中的意义研究

论文摘要

研究背景和目的:如何预测和克服肿瘤细胞对化疗药物的耐药性,实施个体化治疗是肿瘤化疗急需解决的问题。大量研究已经证实DNA损伤修复蛋白O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase,MGMT）在肿瘤组织中的表达与肿瘤细胞对烷化剂药物的耐药密切相关,并影响肿瘤的化疗效果和肿瘤患者的预后。成为预测肿瘤对烷化剂药物敏感性,指导临床实施预见性、个体性化疗方案标志分子,但MGMT蛋白相关检测方法受到较多因素干扰,影响到个体性化疗方案的实施。近年来,与基因甲基化密切相关的MGMT基因表观沉默取得较大进展,目前的研究发现很多肿瘤中MGMT基因转录失活是由基因启动子CpG岛甲基化引起的。MGMT基因甲基化有可能成为肿瘤诊断及预测肿瘤对烷化剂药物敏感性的标志分子。本研究从基础和临床两方面探讨了肿瘤MGMT启动子CpG岛甲基化与MGMT蛋白表达及肿瘤细胞对化疗药物耐药性相关性,以期评估检测MGMT启动子CpG岛甲基化在预测肿瘤细胞对烷化剂化疗药物耐受性,指导临床实现预见性、个体化治疗中的意义。研究方法:研究对象为12株人肿瘤细胞株、39例脑胶质瘤患者肿瘤组织、32例患者血清和17例骨肉瘤患者的肿瘤组织。采用甲基化特异性PCR（Methylation-soecificialpolymerase chain reaction,MSP）方法检测MGMT启动子区CpG岛甲基化状态;MTT方法测定肿瘤细胞株对两种烷化剂尼莫司汀（Nimustine hydrochloride,ACNU）及替莫唑胺（Temozolomide,TMZ）敏感性,以肿瘤细胞株50%存活率的药物浓度(IC50值)作为衡量细胞对药物敏感性的指标。蛋白印迹和免疫组化方法检测肿瘤细胞和组织中MGMT蛋白表达。实验结果采用SPSS13.0统计软件处理,实验数据和资料统计学意义分别用t检验和单因素方差分析、Fisher’s确概率法及非参数秩和检验,相关性检验采用Spearman相关系数分析。P≤0.05为有显著性统计学意义。研究内容和结果:（一）筛查12株人肿瘤细胞株MGMT启动子CpG岛甲基化状态、蛋白表达及细胞对烷化剂ACNU和TMZ药物敏感性特性。结果显示,肿瘤细胞株MGMT启动子CpG岛甲基化状态与MGMT蛋白表达及细胞对两种烷化剂ACNU及TMZ药物敏感性有较好的相关性。在12株肿瘤细胞株中,有4株细胞MGMT启动子CpG岛甲基化,占33.3%（4/12）,其中3株MGMT蛋白缺失,1株低表达;而8株MGMT启动子CpG岛未甲基化的肿瘤细胞株均有MGMT蛋白表达。经Spearman相关系数统计分析,肿瘤细胞株MGMT启动子CpG岛甲基化与MGMT蛋白低表达有显著相关性（P＜0.05）。4株MGMT启动子CpG岛甲基化肿瘤细胞株对烷化剂ACNU、TMZ药物IC50值均小于IC50值中位数,表现为对两种烷化剂药物敏感。而MGMT启动子CpG岛未甲基化肿瘤细胞株均表现为对烷化剂耐药。表明肿瘤细胞株MGMT启动子CpG岛甲基化与肿瘤细胞对烷化剂药物敏感性直接相关。（二）MGMT活性抑制剂链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）和DNA脱甲基化剂5-氮-2’-脱氧胞苷（5-aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR）预处理两株脑胶质瘤细胞SHG-44及U251细胞,观测处理后细胞对两种烷化剂药物敏感性的变化。正常培养条件下,肿瘤细胞株SHG-44细胞MGMT启动子CpG岛甲基化,MGMT蛋白阴性表达,其对ACNU和TMZ的IC50值分别为30.61μg/ml、11.24μg/ml,表现为对2种烷化剂药物敏感;细胞株U251细胞MGMT启动子CpG岛未甲基化,蛋白阳性表达,对ACNU及TMZ药物的IC50值分别为93.62μg/ml、25.12μg/ml,表现为对两种烷化剂耐药;STZ联合ACNU/TMZ用药,可以显著增强两种烷化剂药物对MGMT启动子CpG岛未甲基化细胞株U251细胞的毒性,而对MGMT启动子CpG岛甲基化细胞株SHG-44细胞IC50值影响不明显。在5-Aza-CdR诱导下,MGMT启动子CpG岛甲基化的SHG-44细胞其MGMT启动子完全脱甲基化,MGMT蛋白又恢复了表达,同时对烷化剂ACNU及TMZ药物敏感性也发生逆转,脱甲基化细胞对ACNU和TMZ的IC50值分别升高了3.1和2.5倍,由敏感逆转为耐受;而MGMT启动子CpG岛未甲基化的肿瘤细胞株U251细胞在5-Aza-CdR诱导前后,蛋白表达及对两种烷化剂敏感性无明显变化。脱甲基化实验及STZ联合烷化剂用药试验结果从正反两个方面证实,肿瘤细胞株MGMT启动子CpG岛甲基化是MGMT蛋白失表达的重要机制,并影响肿瘤细胞对烷化剂化疗药物的耐药性。调节肿瘤MGMT启动子CpG岛甲基化状态可以逆转肿瘤细胞对烷化剂药物敏感性。（三）脑胶质瘤和骨肉瘤肿瘤组织中MGMT启动子CpG岛甲基化状态检测。脑胶质瘤和骨肉瘤组织中MGMT启动子CpG岛甲基化发生率不同,脑胶质瘤组织MGMT启动子CpG岛甲基化发生率较高,为46.2%（18/39）,骨肉瘤组织中MGMT启动子CpG岛甲基化发生率为23.5%（4/17）,而正常组织均未检测出基因甲基化,提示MGMT启动子CpG岛甲基化可能是肿瘤细胞特有的现象。两种肿瘤组织中MGMT启动子CpG岛甲基化状态与蛋白表达密切相关。在18例MGMT启动子CpG岛甲基化胶质瘤标本中,有14例MGMT蛋白表达阴性,4例蛋白表达阳性;而在21例启动子未甲基化标本中只有1例阴性表达,20例MGMT阳性表达。在4例MGMT启动子CpG岛甲基化的骨肉瘤组织标本中,有3例MGMT蛋白表达阴性,1例为阳性表达;而在13例MGMT启动子CpG岛未甲基化标本中,只有2例MGMT蛋白阴性表达,11例阳性表达。两种肿瘤组织中MGMT启动子CpG岛甲基化状态与蛋白表达具有显著相关性（均P＜0.05）。相关性分析还发现脑胶质瘤患者的年龄、性别以及病理分级等临床病理参数均与MGMT启动子CpG岛甲基化无显著相关性（均P＞0.05）。为了进一步探讨肿瘤组织MGMT启动子CpG岛甲基化状态与临床化疗疗效的关系,将脑胶质瘤患者随访资料针对MGMT启动子CpG岛甲基化状态绘制生存曲线,进行生存期分析。在进行手术切除、放疗和烷化剂化疗等综合治疗的39例脑胶质瘤患者中,18例MGMT启动子CpG岛甲基化患者中位生存期为26个月,而21例MGMT启动子CpG岛未甲基化患者的中位生存期仅为16个月,MGMT启动子CpG岛甲基化脑胶质瘤患者比未甲基化患者中位生存期明显延长。通过比较,MGMT启动子CpG岛甲基化脑胶质瘤患者生存期与MGMT启动子CpG岛未甲基化患者生存期有显著性差异（P＜0.05,Log-rank检验）。（四）脑胶质瘤患者血清中MGMT启动子CpG岛甲基化状态检测。结果显示,脑胶质瘤患者血清中能够检测出MGMT启动子CpG岛甲基化,并且与对应肿瘤组织中MGMT启动子CpG岛甲基化发生率有较好的相关性。在32例脑胶质瘤患者血清样本中,MGMT启动子CpG岛甲基化发生率为40.6%（13/32）,与肿瘤组织中46.2%甲基化发生率相当。在21例留有组织和血清的配对样本中,组织中MGMT启动子CpG岛甲基化率为42.9%（9/21）,血清MGMT启动子CpG岛甲基化率为33.3%（7/21）,血清中MGMT启动子CpG岛甲基化发生率与配对的肿瘤组织MGMT启动子CpG岛甲基化发生率密切相关（P＜0.01,Fisher’s确切概率检验）。另外,肿瘤组织未检测出MGMT启动子CpG岛甲基化的患者血清中均未检测出MGMT启动子CpG岛甲基化。结论:（1）肿瘤细胞和组织中MGMT启动子CpG岛甲基化状态与MGMT蛋白表达密切相关,MGMT启动子CpG岛甲基化,蛋白低表达,MGMT启动子CpG岛脱甲基化,MGMT蛋白恢复表达。提示MGMT启动子区CpG岛甲基化是导致该基因功能丧失的重要机制,并影响肿瘤细胞对烷化剂药物的敏感性。（2）肿瘤细胞MGMT启动子CpG岛甲基化与细胞对烷化剂药物的敏感性有直接的关系。MGMT启动子CpG岛甲基化,细胞对烷化剂敏感,MGMT启动子CpG岛脱甲基化,细胞对烷化剂敏感性发生逆转,由敏感逆转为耐药。检测MGMT启动子CpG岛甲基化是预测肿瘤对烷化剂化疗药物敏感性好的标记分子。通过检测肿瘤细胞MGMT启动子CpG岛甲基化状态来推测其MGMT蛋白的表达,在预测肿瘤对烷化剂药物耐受性,指导临床个体化化疗中具有重要意义。（3）患者血清中能够检测到肿瘤相关的MGMT启动子CpG岛甲基化,提示肿瘤患者血清有可能为临床肿瘤诊断提供一种无创性检测系统。脑胶质瘤患者血清中MGMT启动子CpG岛甲基化发生率与组织中甲基化发生率有显著相关性,测定胶质瘤患者血清中MGMT启动子CpG岛甲基化状态能够反映出组织中相关基因甲基化状态。检测血清MGMT启动子CpG岛化状态可以克服以往采用免疫组化方法检测患者组织中MGMT表达水平的方法局限性,有可能为临床提供一种新的无创性检测方法,拓宽了基因甲基化检测在肿瘤个体化治疗及预见性化疗中的应用范围和应用前景。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 肿瘤细胞株MGMT启动子甲基化状态与蛋白表达及对烷化剂药物敏感性相关性
• 1 实验材料和仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 第二部分 肿瘤组织及血清中MGMT启动子甲基化状态研究
• 1 实验材料和仪器
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 5 小结
• 总结
• 参考文献
• 文献综述
• 博士期间发表的论著
• 个人简历
• 致谢