论文摘要
本课题在较全面综述近年来芦荟研究进展及肝癌中西医综合治疗研究的基础上,重点开展了芦荟多糖干预的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）对肝癌细胞生长的作用及其机制的实验研究。文献研究表明,芦荟多糖具有调节免疫、抗肿瘤、抗辐射、保肝、降血糖、促进创伤和溃疡愈合及抗炎、抗病毒等多方面的药理活性。其中,芦荟多糖的抗肿瘤作用是我国近年芦荟研究的热点之一,但已有的研究多为动物实验研究,研究成果多数尚待临床研究证实。本课题通过研究芦荟多糖AP11干预的PBMC对肝癌细胞生长的作用,从细胞水平探讨了芦荟多糖的抗肿瘤作用机制。目的:通过研究芦荟多糖AP11干预的PBMC对肝癌细胞生长的作用,探讨芦荟多糖的抗肿瘤作用机制。方法:1、采用水提醇沉法提取芦荟粗多糖,无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤,三氯乙酸除蛋白,得精制芦荟粗多糖AP1,选用10万分子量与3万分子量的超滤膜截留不同分子量芦荟多糖AP11（分子量＞10万）、AP12（3万＜分子量＜10万）、AP13（分子量＜3万）,蒽酮-浓硫酸法测定各多糖含量,考马斯亮蓝染色法测定蛋白含量。2、采用人淋巴细胞分离液、Ficoll Hypaque密度梯度离心法分离PBMC。AlamarBlue法测定不同浓度芦荟多糖AP11、AP12、AP13对PBMC生长的影响,MTT法测定不同浓度芦荟多糖AP11、AP12、AP13对HepG2生长的影响。3、Alamar Blue法测定芦荟多糖AP11单独及联合Anti-CD3McAb、rhIL-2对PBMC生长的影响。MTT法测定多糖AP11干预后PBMC上清及PBMC细胞悬液对HepG2生长的影响。酶联免疫吸附试验（ELISA）测定多糖AP11对PBMC各组上清中IFN-γ、TNF-α水平的影响,流式细胞仪检测其FasL的表达。ELISA法测定干预后各组PBMC对HepG2上清中IFN-γ、TNF-α水平的影响,AKP检测试剂盒测定对AKP水平的影响,流式细胞仪检测干预后HepG2细胞周期、凋亡率及其Fas的表达。4、以手术切除肝癌组织为标本,胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养法原代培养肝癌细胞,通过倒置显微镜观察其形态学特征。并于分离培养的第2天,加芦荟多糖AP11、芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC于癌细胞中,倒置显微镜观察其对癌细胞形态的影响。MTT法测定其对癌细胞生长的影响。结果:1、从库拉索芦荟凝胶冻干粉中提取的芦荟多糖AP1、AP11、AP12、AP13中多糖所占比例分别为58%、79%、84%和85%;蛋白含量分别为15.61μg/mL、13.33μg/mL、21.03μg/mL和10.70μg/mL。2、人淋巴细胞分离液、密度梯度离心法可成功分离PBMC,细胞的存活率可达95%以上。不同分子量芦荟多糖对PBMC的生长有一定的促进作用。与PBMC空白对照组相比,AP11（200μg/mL）组可显著促进PBMC生长（P＜0.01）。与空白对照HepG2组相比,各浓度AP11、AP12、AP13组对HepG2生长的影响没有明显差异（P＞0.05）。3、与空白对照PBMC组（BC组）相比,芦荟多糖AP11及其联合Anti-CD3McAb、rhIL-2对PBMC的生长有不同程度地促进作用。与空白对照HepG2组（H组）相比,干预后各组PBMC效应细胞的上清液对HepG2生长的影响无明显差异（P＞0.05）,干预后各组PBMC效应细胞可不同程度抑制HepG2的生长。光镜下观察可见,H组细胞以多边形细胞为主,细胞核异型性明显,核仁清晰,核大,胞浆透明。与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组CIAP+H组细胞镜下生长视野减少,均出现不同程度的形态改变,大多细胞呈梭形、蝌蚪形,部分细胞皱缩,变黑、变圆。芦荟多糖AP11对PBMC上清中IFN-γ水平的影响:与BC组相比,CI组和CIAP组的IFN-γ水平显著提高（P＜0.01）;与AP组比,CI组和CIAP组的IFN-γ水平显著提高（P＜0.01）,与BC组相比差异显著（P＜0.01）。芦荟多糖AP11对PBMC上清中TNF-α水平的影响:BC组、AP组、CI组和CIAP组之间的TNF-α水平无明显变化（P＞0.05）。效应细胞对靶细胞HepG2上清中IFN-γ水平的影响:与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组与CIAP+H组IFN-γ水平显著提高（P＜0.01）;与BC+H组相比,AP+H组、CI+H组与CIAP+H组IFN-γ水平显著提高（P＜0.01）。效应细胞对靶细胞HepG2上清中TNF-α水平的影响:与H组相比,BC+H组有增高的趋势,AP+H组、CI+H组与CIAP+H组TNF-α水平显著提高（P＜0.01）;与BC+H组比,AP+H组TNF-α水平有明显提高（P＜0.05）,CI+H组与CIAP+H组TNF-α水平显著提高（P＜0.01）。流式细胞仪检测结果显示,H组细胞在正常二倍体细胞DNA峰（G1峰）前无明显的亚二倍体凋亡峰,细胞凋亡率很低（5.13%）,更多处于S期（43.33%）,较少处于G1期（52.27%）;与H组相比,CIAP+H组中靶细胞在G1峰前出现明显的凋亡峰,凋亡率显著增高（30.37%,P＜0.01）,S期比例降低（24.37%,P＜0.05）,较多处于G1期（75.63%,P＜0.05）。与H组相比,其余各组靶细胞都有凋亡峰出现,其凋亡率、S期比例都有不同程度降低,G1期比例有不同程度增加。芦荟多糖AP11对PBMC FasL表达的影响:与BC组相比,AP组、CI组和CIAP组的FasL荧光表达率升高。效应细胞对HepG2 Fas表达的影响:与H组相比,BC+H组、AP+H组、CI+H组与CIAP+H组的Fas荧光表达率升高。4、胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞。培养6h后即可在倒置显微镜下观察到贴壁细胞,48h可观察到细胞呈单个或团块状贴壁生长,每个团块约有20～100个不等的细胞,有的细胞已经完全贴壁展开。倒置显微镜下,活细胞以多边形或不规则上皮样细胞为主,有少量梭形细胞。细胞核异型性明显,核仁清晰,核大,胞质少,胞浆内可见丰富颗粒及空泡。与未加多糖干预的空白对照组相比,癌细胞在数量及形态上没有明显的变化。与未加PBMC干预的癌细胞相比,芦荟多糖AP11干预及未干预的PBMC作用于癌细胞后,癌细胞形态发生明显变化,细胞混合后6h,一部分细胞形态由多边形变为梭形,一部分细胞皱缩,变黑、变圆。MTT实验结果表明,与癌细胞空白对照组比,芦荟多糖AP11对原代肝癌细胞生长的影响没有明显差异（P＞0.05）;芦荟多糖AP11干预及未干预PBMC组可明显抑制肝癌细胞的生长（P＜0.01）。结论:1、在传统多糖提取工艺的基础上,得到纯度较高的不同分子量芦荟多糖AP11、AP12、AP13,为本研究提供了理想的实验用药。2、成功建立PBMC分离方法。PBMC体外分离后第1天,其数量有下降趋势,第4～6天比较稳定,我们选用处于稳定期的细胞作为实验用细胞模型。PBMC的活性与供血者体质及体外培养条件有关。芦荟多糖AP11（200μg/mL）组可显著促进PBMC生长。不同分子量的芦荟多糖对HepG2的生长没有明显抑制作用。3、芦荟多糖AP11单独及其联合Anti-CD3McAb与rhIL-2应用可显著促进体外PBMC的增值,同时可增加PBMC IFN-γ的分泌,增强FasL的表达。表明其可以促进PBMC的增殖,并能增强其分泌杀伤肿瘤活性细胞因子IFN-γ的分泌,提示其抗肿瘤作用与增强机体免疫,诱导细胞凋亡有关。芦荟多糖AP11干预的PBMC效应细胞上清液对HepG2的生长没有明显抑制,而PBMC效应细胞可以显著抑制HepG2的生长,并能诱导HepG2靶细胞的凋亡、改变其细胞周期。此外,还能增加混合培养后细胞上清中IFN-γ、TNF-α的水平,降低AKP的水平及增强靶细胞Fas蛋白的表达。提示芦荟多糖AP11的抗肿瘤作用与降低肿瘤细胞活性、改变细胞周期、提高IFN-γ和TNF-α水平,通过IFN-γ与TNF-α的协同作用及激活Fas/FasL途径、诱导凋亡有关。4、胰酶短暂消化加吹打分离、单细胞悬液培养的方法,可成功获取原代肝癌细胞。其活性与肝癌患者发病阶段及体外培养条件有关。芦荟多糖对原代培养肝癌细胞的生长及形态没有明显作用。芦荟多糖干预及未干预的自体PBMC对原代肝癌细胞有明显的抑制作用。
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