拟南芥异三聚体G蛋白β和γ亚基在毕赤酵母中的表达及β亚基和RACK1相互作用研究

论文摘要

异三聚体GTP结合蛋白（heterotrimeric GTP-binding proteins, G蛋白）是活细胞内一类具有重要生理调节功能的蛋白质。自从上世纪70年代初在动物细胞中首先发现G蛋白的存在以来,有关G蛋白的研究发展迅速。对于植物G蛋白的研究于80年代后期才开始,处于相对滞后阶段。拟南芥是一种重要的模式植物,对拟南芥异三聚体G蛋白功能和作用机制的研究对于阐明其他植物中G蛋白的功能和作用机制有着重要的参考意义。而一直以来研究较多的是异三聚体G蛋白的主要功能亚基Gα,通常认为Gβγ的功能只是作为α亚基的负调节器并将其固定于细胞质膜上。最近的研究认为,Gβγ二聚体是细胞信号系统中的主要纽带之一,是调节代谢和生长信号传递的信号系统中的重要功能性亚基。本实验首先从拟南芥植物中分离克隆了G蛋白的β和γ亚基,通过转基因手段成功地将克隆的基因转化到巴斯德毕赤酵母中。利用巴斯德毕赤酵母表达体系成功表达了拟南芥异三聚体G蛋白的β和γ亚基。在本实验培养条件下,β、γ1和γ2亚基的表达量分别为483.3μg/mL、365μg/mL和359.7μg/mL。另外,以拟南芥野生型Col、G蛋白β亚基功能缺失突变体agb1-2, RACK1蛋白功能缺失突变体rack1以及G蛋白β亚基和RACK1蛋白功能都缺失的双突变体agb1-2/rack1种子为材料,研究AGB1和RACK1蛋白在拟南芥种子萌发过程中的作用,结果表明它们共同参与了拟南芥种子萌发过程中对春化作用、糖和激素的响应。经GST pull down技术研究证实两者之间不存在相互作用,说明它们存在各自的作用途径。最后,利用Topo克隆和Gateway亚克隆技术转化RACK1-GFP到农杆菌中,并分别用PEG-Ca溶液和农杆菌介导转化重组质粒到Col原生质体和悬浮培养细胞中,利用荧光显微镜观察RACK1蛋白在原生质体和细胞中的定位,进而分析其功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1. 植物异三聚体 G 蛋白研究进展
• 1.1 植物异三聚体G 蛋白的结构
• 1.2 植物异三聚体G 蛋白的偶联信号
• 1.2.1 与 G 蛋白相关的胞外环境信号
• 1.2.2 GPCR
• 1.2.3 与 G 蛋白作用的效应器
• 1.2.4 G 蛋白信号传递中的调节子
• 1.3 异三聚体 G 蛋白在植物细胞信号转导中的作用
• 1.3.1 激素信号
• 1.3.1.1 生长素信号
• 1.3.1.2 ABA 信号
• 1.3.1.3 GA 信号转导
• 1.3.2 病原信号
• 1.3.3 顶端生长细胞
• 2. 巴斯德毕赤酵母外源基因表达系统研究进展
• 2.1 常用表达菌株及表达载体
• 2.1.1 表达菌株
• 2.1.2 表达载体
• 2.2 基因整合及表达调控的机理
• 2.2.1 基因整合
• 2.2.2 调控机制
• 2.3 外源基因自身特性对 P. pastoris 表达系统的影响
• 2.4 外源蛋白的翻译后修饰
• 3. GST pull down 方法概述
• 4. Topo 克隆及 Gateway 亚克隆方法概述
• 5. 本研究的目的及内容
• 第二章 利用巴斯德毕赤酵母表达拟南芥异三聚体G 蛋白β和γ亚基
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种及载体
• 2.1.2 主要试剂和相关溶液的配制
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 目的基因 AGB1、AGG1 和 AGG2 的克隆
• 2.2.2 TA 克隆 PCR 产物
• 2.2.2.1 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备
• 2.2.2.2 目的片段与克隆载体的连接及转化
• 2.2.2.3 阳性克隆的筛选
• 2.2.3 DNA序列分析
• 2.2.4 TA 克隆产物与表达载体的连接及转化
• 2.2.5 连接重组子的电击转化
• 2.2.5.1 组氨酸缺陷型酵母菌株的筛选
• 2.2.5.2 甲醇利用正常型酵母菌株的筛选
• 2.2.5.3 GS115 感受态的制备
• 2.2.5.4 重组子的电击转化
• 2.2.5.4.1 重组 DNA 的线性化
• 2.2.5.4.2 线性化DNA 的去磷酸化及纯化
• 2.2.5.4.3 线性化 DNA 的电击转化
• 2.2.6 毕赤酵母 GS115 中重组子的鉴定
• 2.2.6.1 毕赤酵母GS115 基因组的提取
• 2.2.6.2 毕赤酵母GS115 中重组子的鉴定
• 2.2.7 目的蛋白的诱导表达
• 2.2.8 SDS-PAGE 检测目的蛋白
• 2.2.8.1 Bradford 法测蛋白浓度
• 2.2.8.2 SDS-PAGE
• 2.2.9 目的蛋白的分离纯化
• 3. 结果与分析
• 3.1 PCR 扩增目的基因AGB1、AGG1 和AGG2
• 3.2 TA 克隆产物鉴定
• 3.3 序列比对结果
• 3.4 目的基因与表达载体连接产物鉴定
• 3.5 毕赤酵母 GS115 重组子的鉴定
• 3.6 目的蛋白的检测
• 4. 讨论
• 第三章 AGB1 和RACK1 蛋白对拟南芥种子萌发的作用研究
• 1. 前言
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种及载体
• 2.1.3 主要试剂和相关溶液的配制
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 AGB1 和 RACK1 蛋白对拟南芥种子萌发的影响
• 2.2.2.1 春化作用对拟南芥种子萌发的影响
• 2.2.1.2 不同处理对拟南芥种子萌发的影响
• 2.2.2 利用GST pull down 研究 AGB1 和RACK1 蛋白的相互作用
• 2.2.2.1 目的基因 AGB1、RACK1 的克隆
• 2.2.2.2 TA 克隆PCR 产物
• 2.2.2.2.1 大肠杆菌 DH5α感受态细胞的制备（见第二章2.2.2.1）
• 2.2.2.2.2 目的片段与克隆载体的连接及转化（见第二章2.2.2.2）
• 2.2.2.2.3 阳性克隆的筛选（见第二章2.2.2.3）
• 2.2.2.3 DNA 序列分析（操作见第二章2.2.3）
• 2.2.2.4 TA 克隆产物与表达载体的连接及转化（见第二章2.2.4）
• 2.2.2.5 连接重组子的转化到大肠杆菌 BL21
• 2.2.2.5.1 大肠杆菌 BL21 感受态细胞的制备（同第二章2.2.2.1）
• 2.2.2.5.2 连接重组子的转化
• 2.2.2.6 大肠杆菌 BL21 中重组子的鉴定
• 2.2.2.7 目的蛋白的诱导表达
• 2.2.2.7.1 RACK1 蛋白的诱导表达
• 2.2.2.7.2 AGB1/GST 融合蛋白的诱导表达
• 2.2.2.8 目的蛋白的分离纯化
• 2.2.2.8.1 RACK1 蛋白的纯化（操作见第二章2.2.9）
• 2.2.2.8.2 AGB1/GST 融合蛋白的纯化
• 2.2.2.9 SDS-PAGE 检测目的蛋白（操作见第二章2.2.8）
• 2.2.2.10 RACK1 蛋白与AGB1/GST 融合蛋白的相互作用
• 2.2.3 RACK1 蛋白的细胞定位
• 2.2.3.1 RACK1 基因的克隆
• 2.2.3.2 Topo 克隆 PCR 产物
• 2.2.3.3 Topo 克隆产物的鉴定
• 2.2.3.4 DNA 序列分析
• 2.2.3.5 Topo 克隆产物与Gateway 载体的LR 反应及转化
• 2.2.3.6 LR 反应产物的鉴定
• 2.2.3.7 重组质粒转化农杆菌GV3101
• 2.2.3.7.1 农杆菌GV3101 感受态细胞的制备
• 2.2.3.7.2 重组质粒转化农杆菌GV3101 感受态细胞
• 2.2.3.8 农杆菌GV3101 重组子的鉴定
• 2.2.3.9 PEG 介导重组质粒转化拟南芥Col 原生质体
• 2.2.3.10 农杆菌介导重组质粒转化拟南芥 Col 细胞
• 2.2.3.10.1 拟南芥 Col 悬浮培养细胞系的建立
• 2.2.3.10.2 细胞转化
• 3. 结果与分析
• 3.1 AGB1 和 RACK1 蛋白对拟南芥种子萌发的作用
• 3.1.1 春化作用对拟南芥种子萌发的影响
• 3.1.2 糖对拟南芥种子萌发的影响
• 3.1.3 激素对拟南芥种子萌发的影响
• 3.2 利用GST pull down 研究 AGB1 和RACK1 蛋白的相互作用
• 3.2.1 PCR 扩增目的基因AGB1 和 RACK1
• 3.2.2 TA 克隆产物的鉴定
• 3.2.3 序列比对结果
• 3.2.4 目的基因与表达载体连接产物鉴定
• 3.2.5 大肠杆菌 BL21 重组子的鉴定
• 3.2.6 目的蛋白的检测
• 3.3 RACK1 蛋白的细胞定位
• 3.3.1 PCR 扩增目的基因RACK1
• 3.3.2 Topo 克隆产物的鉴定
• 3.3.3 DNA 序列分析（见3.2.3）
• 3.3.4 LR 反应产物的鉴定
• 3.3.5 农杆菌 GV3101 重组子的鉴定
• 3.3.6 RACK1 蛋白在拟南芥 Col 原生质体中的瞬时表达
• 3.3.7 RACK1 在拟南芥Col 细胞中的定位
• 4. 讨论
• 参考文献
• 致谢