家蚕皮肤胰蛋白酶抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂的初步分离纯化及性质研究

论文摘要

家蚕（Bombyx mori），也叫桑蚕，属于无脊椎动物，昆虫纲，鳞翅目，家蚕蛾科。当家蚕遇到外界的物理、化学和生物等因素的刺激后，其血淋巴中很快出现一系列免疫物质如抗菌蛋白、抗菌多肽、溶菌酶及凝集素等抗菌物质以对抗外源微生物的人侵，而这些抗菌物质可望成为一类新的高效低毒的抗菌、抗病毒和抗癌新药，为了研究家蚕皮肤中是否存在这种抗菌物质或者具有其它药用价值的组分，本论文主要检测了家蚕皮肤中的胰蛋白酶抑制剂和血管紧张素转化酶抑制剂并对其进行了初步的分离纯化和性质研究，主要内容如下：1家蚕皮肤胰蛋白酶抑制剂的初步分离纯化及性质研究以家蚕为实验材料，从家蚕皮肤中部分纯化出一种胰蛋白酶抑制剂，并对其性质进行了初步的研究。抽提家蚕皮肤和体液组织总蛋白，通过检测不同的胰蛋白酶、明胶浓度以及酶解时间对电泳的影响，确立了进行活性电泳的最适条件为：活性电泳时分离胶中含有0.075％的明胶，电泳结束后用0.1mg／ml胰蛋白酶酶解1h。家蚕皮肤总蛋白样品抽提液经70％硫酸铵沉淀盐析，透析脱盐后得到粗酶液。利用明胶-PAGE活性电泳研究家蚕皮肤粗酶液中胰蛋白酶抑制剂的种类以及各抑制剂的热稳定性。粗酶液中共检测到8种胰蛋白酶抑制剂，大多数抑制剂均具有一定的热稳定性，40℃处理后活性几乎不受影响，50℃处理后活性减弱，60℃以上多数抑制剂活性完全丧失，但有两种抑制剂具有较高的热稳定性，经过100℃煮沸后其活性几乎不受影响。进一步利用DEAE-52纤维素离子交换层析对粗酶液进行纯化，用含不同盐浓度的缓冲液分步洗脱，分别收集各洗脱峰，透析脱盐，PEG20000浓缩后用明胶-PAGE活性电泳检测纯化结果。粗酶液中的胰蛋白酶抑制剂主要集中在0.1 M NaCl和0.2 M NaCl洗脱峰中，其中0.1 M NaCl洗脱峰主要含有一些热稳定性相对较高的抑制剂种类。2家蚕皮肤血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂的检测和初步分离纯化用两种不同底物分别测定血管紧张素转化酶的活性，评价了血管紧张素转化酶抑制剂体外活性筛选的适用范围。用两种方法分别测定ACE和ACE的专一性抑制剂卡托普利的抑制活性，两种方法测定的结果一致，且卡托普利的IC50和文献报道的一致。利用上述模型检测到家蚕皮肤粗酶液中存在天然的血管紧张素转化酶抑制剂，粗酶液经过DEAE-52纤维素进一步纯化，发现上述抑制剂活性主要分布在0.1 M NaCl的洗脱峰中，说明家蚕皮肤中存在的血管紧张素转化酶抑制剂可能是蛋白或多肽，而非无机或有机化合物。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词对照表
• 第一章 文献综述
• 一 家蚕概述
• 二 蛋白酶抑制剂及其研究进展
• 1 蛋白酶抑制剂的类型
• 2 蛋白酶抑制剂的作用机制
• 3. 蛋白酶抑制剂的应用
• 3.1 基础研究方面
• 3.2 医药学的研究领域
• 3.3 蛋白酶抑制剂的抗虫作用以及在抗虫植物基因工程中的应用
• 4 家蚕蛋白酶抑制剂研究概况
• 5 家蚕蛋白酶抑制剂存在的生理意义山
• 三 血管紧张素转化酶抑制剂及其应用研究进展
• 1 ACEI的分类
• 2 ACEI的作用机制
• 3 ACEI的药理学研究
• 3.1 对心脑血管疾病的作用
• 3.2 对糖尿病的作用
• 3.3 对肾病及高血压肾病的作用
• 3.4 抗动脉粥样硬化
• 3.5 镇痛抗炎作用
• 4 副作用
• 参考文献
• 第二章 家蚕皮肤胰蛋白酶抑制剂的初步分离纯化及性质研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 蛋白样品提取液的制备
• 1.3.1 家蚕体液蛋白样品提取液的制备
• 1.3.2 家蚕皮肤蛋白样品提取液的制备
• 1.4 家蚕皮肤TI粗酶液的制备
• 1.5 家蚕皮肤TI的初步纯化
• 1.6 蛋白含量的测定
• 1.7 PAGE
• 1.8 家蚕皮肤TI活性的测定
• 1.8.1 明胶-PAGE活性电泳
• 1.8.2 BAPNA法
• 1.9 家蚕皮肤TI热稳定性实验
• 2 结果与讨论
• 2.1 明胶-PAGE活性电泳检测胰蛋白酶抑制剂最适条件的建立
• 2.1.1 不同的酶解时间对电泳的影响
• 2.1.2 高浓度明胶下不同浓度的胰酶对电泳的影响
• 2.1.3 低浓度明胶下不同浓度的胰酶对电泳的影响
• 2.1.4 最适条件下家蚕体液和皮肤中TI的活性电泳图谱
• 2.2 粗提液的制备和抑制活性的测定
• 2.3 明胶-PAGE活性染色电泳测定胰蛋白酶抑制剂活性的可行性的理论依据
• 2.4 粗酶液的胰蛋白酶抑制剂的热稳定性实验
• 2.5 家蚕皮肤粗酶液的初步纯化
• 3.本章小结
• 参考文献
• 第三章 家蚕皮肤血管紧张素转化酶抑制剂的检测及初步分离纯化
• 1 实验材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 家蚕皮肤粗酶液的制备
• 1.4 粗酶液的初步纯化
• 1.5 蛋白含量测定
• 1.6 ACE酶液的提取
• 1.7 ACE酶活力的测定
• 1.7.1 以FAPGG为底物
• 1.7.2 以 HHL 为底物
• 1.8 卡托普利对 ACE 的抑制作用
• 1.8.1 以 FAPGG 为底物
• 1.8.2 以 HHL 为底物
• 1.9 以 FAPGG 为底物测定家蚕皮肤粗酶液对 ACE 抑制作用
• 2 结果与讨论
• 2.1 结果计算
• 2.2 血管紧张素转化酶抑制剂体外活性测定方法的建立
• 2.3 家蚕皮肤粗酶液对血管紧张素转化酶抑制作用
• 2.4 经过 DEAE-52 纤维素层析纯化后洗脱峰对 ACE 的抑制作用
• 3. 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 创新之处
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表的论文
• 附录