杂色鲍若干免疫相关基因的克隆和分析

论文摘要

杂色鲍（Haliotis diversicolor supertexta,small abalone）是我国极为重要的养殖贝类之一,然而近年来养殖过程中病害频发,已成为产业发展的瓶颈之一。研究杂色鲍免疫相关基因,对于解释杂色鲍的抗病机理、探索病害防治新途径从而保证鲍养殖业的持续健康发展具有重要的意义。本研究结合EST序列分析和SMART RACE技术克隆获得杂色鲍巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, samif）、皮肤桥蛋白2（dermatopontin 2, sadpt2）、β葡聚糖识别蛋白（β-1,3-glucan recognition protein, saβgrp）基因的全长cDNA序列和肽聚糖识别蛋白（peptidoglycan recognition protein, sapgrp）基因三个亚型的cDNA序列片段,同时采用PCR技术克隆获得杂色鲍mif的全长基因组DNA,head to toe PCR技术检测全长cDNA序列的正确性,并采用实时定量PCR技术分析杂色鲍经副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）感染后和在环境有机污染物三丁基锡（tributyltin,TBT）暴露下samif、sadpt2、saβgrp基因的表达情况。结果如下:（1）samif的cDNA全长为535 bp,开放阅读框编码128个氨基酸,预测分子量为14 kDa。基因组DNA长3237 bp,包含三个外显子和两个内含子。实时定量PCR显示,samif在肝胰腺、肌肉、卵巢、鳃、外套膜和上足等6个组织中为组成性表达,其中在肝胰腺的表达量最高（p <0.01）;此外,在肝胰腺中24 h和48 h的弧菌组samif的表达水平极显著高于对照组（p <0.01）,TBT暴露后杂色鲍肝胰腺的mif基因表达未见显著性变化（p >0.05）。（2）sadpt2的cDNA全长为584 bp,包括58 bp的5’非编码区,471 bp的开放阅读框,55 bp的3’非编码区。sadpt2开放阅读框编码156个氨基酸,预测分子量为18.3 kDa。经副溶血弧菌诱导后,肝胰腺中的sadpt2基因在24 h时显著高于对照组（p <0.05）,表明它为一种免疫诱导蛋白,参与机体对副溶血弧菌的免疫防御。TBT暴露后,杂色鲍肝胰腺的dpt2基因表达未见限制性变化（p >0.05）。（3）获得的1459 bp saβgrp全长cDNA含一个987 bp ORF,编码328个氨基酸,预测分子量为36.9 kDa。与现有报道的β-1,3-葡聚糖识别蛋白均含信号肽不同,本研究所获得的杂色鲍βGRP不含信号肽,为非分泌型蛋白。实时定量PCR分析表明:经副溶血弧菌诱导后,24 h的实验组saβgrp的表达水平极显著高于对照组（p <0.01）,48 h的实验组saβgrp基因显著高于对照组（p <0.05）。TBT暴露后,杂色鲍肝胰腺的βgrp基因表达未见显著性变化（p >0.05）。（4）杂色鲍pgrp基因三个亚型的cDNA序列片段,分别长804 bp、1015 bp和728 bp,它们与淡水螺pgrp基因短型有很高的同源性,因而我们推测三个亚型可能为杂色鲍pgrp基因短型的三个异构体。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 杂色鲍形态特征、自然分布及生物学特性
• 1.2 本研究的背景和目的意义
• 1.3 表达序列标签在基因鉴别和克隆方面的应用
• 1.4 巨噬细胞移动抑制因子基因的研究进展
• 1.5 皮肤桥蛋白基因的研究进展
• 1.6 模式识别受体基因的研究进展
• 1.6.1 β-1,3-葡聚糖识别蛋白基因的研究进展
• 1.6.2 肽聚糖识别蛋白基因的研究进展
• 1.7 主要研究内容和技术路线
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 主要试剂和仪器
• 2.1.4 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 副溶血弧菌感染及TBT 暴露杂色鲍预实验
• 2.2.2 副溶血弧菌感染及TBT 暴露杂色鲍正式实验
• 2.2.3 总RNA 的提取及检测
• 2.2.4 基因组DNA 的提取和检测
• 2.2.5 EST 序列分析获取目的基因序列片段
• 2.2.6 SMART-RACE 技术克隆目的基因全长
• 2.2.7 杂色鲍MIF 基因组DNA 的克隆
• 2.2.8 割胶纯化目的基因片段
• 2.2.9 与质粒载体连接
• 2.2.10 连接产物转化
• 2.2.11 质粒插入片段的检测
• 2.2.12 质粒测序
• 2.2.13 目的基因的生物信息学分析
• 2.2.14 head to toe PCR 技术检测目的基因开放阅读框的序列准确性
• 2.2.15 目的基因的实时荧光定量PCR 分析
• 第三章 结果
• 3.1 总RNA 提取的结果
• 3.2 杂色鲍基因组DNA 提取的结果
• 3.3 RACE-PCR 扩增结果
• 3.4 杂色鲍MIF 基因组DNA 扩增结果
• 3.5 基因序列分析
• 3.5.1 MIF 基因和基因组DNA 序列分析
• 3.5.2 DPT2 基因序列分析
• 3.5.3 βGRP 基因序列分析
• 3.5.4 PGRP 基因序列分析
• 3.6 荧光定量PCR 分析
• 3.6.1 荧光定量PCR 引物检验结果
• 3.6.2 杂色鲍mif 基因表达特点
• 3.6.3 杂色鲍dpt2 基因表达结果
• 3.6.4 杂色鲍βgrp 基因表达特点
• 第四章 讨论
• 4.1 巨噬细胞移动抑制因子基因
• 4.2 皮肤桥蛋白基因2
• 4.3 β葡聚糖识别蛋白基因
• 4.4 肽聚糖识别蛋白基因
• 第五章 结论和展望
• 致谢
• 参考文献
• 在学期间发表的学术论文和研究成果