棉花启动子突变体库的创建与初步分析

论文摘要

棉花（Gossypium hirsutum）是我国乃至全世界最重要的经济作物。棉纤维是己知纤维素纯度最高的天然资源之一,在世界纺织业中占有重要的地位。但棉花功能基因组学研究却相对落后。T-DNA介导的基因诱捕技术是近年发展起来的鉴定和分离基因的新方法,目前该技术已在植物功能基因组研究中扮演举足轻重的角色。为了挖掘棉花基因组上的信息,配合植物功能基因组研究高通量的策略,给棉花生物技术和常规育种带来新的基因资源,本实验室在国际上首次构建了棉花Promoter-trap（启动子陷阱）体系。该系统以一个没有启动子的GUS基因（β-葡萄糖苷酶基因）为报告基因,NPT-Ⅱ基因（新霉素磷酸转移酶基因）为选择标记基因。当T-DNA中报告基因GUS插入到内源基因启动子下游后,被内源基因启动子的驱动表达,报告基因的表达模式就是靶基因的表达模式。利用根癌农杆菌介导的遗传转化,以T-DNA为载体将promoter trap元件随机插入到棉花基因组,探讨了promoter trap在棉花功能基因组研究中的可行性,取得了以下几方面的进展:1.探讨了农杆菌感染时间、共培养时间、共培养温度对农杆菌转化棉花下胚轴遗传转化率的影响,发现最佳的感染时间、共培养时间、共培养温度分别是5min,21℃,60h,这和金双侠（2006）研究的农杆菌转化胚性愈伤的结果不同。2.利用根癌农杆菌介导的遗传转化,我们获得了212个转化子,172棵独立的突变体植株,经PCR扩增检测,78%的转化植株为阳性。3.系统鉴定了这些突变体植株,获得了一些在形态上与正常植株明显有差异的突变体。4.用组织化学染色手段检测了GUS基因在愈伤阶段、子叶胚、幼苗茎部和幼叶的表达频率和模式。发现GUS在愈伤和茎部中高效表达,在子叶胚中的表达模式也多种多样。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 1 文献综述
• 1.1 棉花基本状况
• 1.2 棉花基因组的特点
• 1.3 植物功能基因组研究
• 1.3.1 全基因组测序和基因注释
• 1.3.2 植物功能基因组学研究手段
• 1.4 农杆菌介导的T-DNA插入突变体库的构建和应用
• 1.4.1 T-DNA整和过程
• 1.4.2 T-DNA插入突变体库的构建和应用
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 2 实验材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 品种
• 2.1.2 农杆菌菌株和转化载体
• 2.1.3 部分试剂来源
• 2.1.4 培养条件及其不同培养基配方
• 2.1.5 缓冲液配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 影响农杆菌转化棉花下胚轴转化效率参数的设置
• 2.2.2 以棉花下胚轴为受体的遗传转化
• 2.2.3 转基因植株的再生和移栽
• 2.2.4 转化愈伤及再生植株不同器官的GUS染色
• 2.2.5 再生植株的分子生物学鉴定
• 2.2.6 Southern杂交
• 3 结果与分析
• 3.1 愈伤诱导过程中愈伤组织的形态观察
• 3.1.1 不同品种出愈时间
• 3.1.2 不同品种愈伤形态的比较
• 3.1.3 不同形态愈伤分化的时间
• 3.2 不同因素对转化效率的影响
• 3.2.1 农杆菌感染时间对转化效率的影响
• 3.2.2 共培养温度对转化效率的影响
• 3.2.3 共培养时间对转化效率的影响
• 3.3 遗传转化与植株再生的结果
• 3.4 转基因再生植株的PCR检测
• 3.5 转基因再生植株的Southern杂交分析
• 3.6 GUS染色检测表达频率
• 3.6.1 GUS基因在愈伤、幼叶以及幼茎中的表达频率
• 3.6.2 GUS基因在子叶胚中的表达频率
• 3.7 转基因再生植株农艺性状的变异规律
• 4 讨论
• 4.1 出愈时间和愈伤分化的关系
• 4.2 正常苗出现过程的观察
• 4.3 以下胚轴为受体的转化体系优化的有效性
• 4.4 Southern杂交失败的原因
• 4.5 突变体的筛选
• 4.6 Promoter-trap系的有效性
• 4.7 突变体饱和度
• 参考文献
• 致谢