水杨酸对大豆耐铝性的调控机制

论文摘要

铝（Aluminum,Al）作为酸性土壤上最主要的非生物胁迫因子严重影响了植物生长和作物产量。对大多数植物而言,土壤中微摩尔浓度的Al即能明显地抑制根伸长。根尖是Al毒害最敏感的部位,Al离子与根尖相互作用,在几分钟之内就能导致植物根伸长受到显著抑制,根尖膨大,严重阻碍植物对养分和水分的吸收。Al诱导大豆根系分泌柠檬酸被认为是其最重要的耐Al机制之一。然而,调控柠檬酸分泌的过程和Al抑制根伸长的机理目前尚不十分清楚。水杨酸（Salicylic acid,SA）作为关键的信号分子参与调控植物体内的多种生理功能,如种子萌发、幼苗生长和各种生物和非生物胁迫响应。在过去几年的研究中,SA在植物抗病方面起着重要的信号调节作用,如诱导植物抗病基因（PR）的表达、激活过敏反应（HR）和系统获得性抗性（SAR）。而最近的研究表明,SA在植物抗非生物胁迫（紫外线辐射、低温、热激、干旱、盐胁迫和重金属毒害等逆境）方面也发挥着至关重要的作用。有证据显示,SA不仅与柠檬酸代谢关键酶-顺乌头酸酶（ACO）和柠檬酸转运体MATE家族密切相关,而且SA介导ROS的产生以及诱导相关基因的表达很可能与调控植物的防御反应有关。因此,本文以大豆耐Al品种吉育70（Glycine max L. cv Jiy u 70）为试验材料,采用液体培养方法,分别从柠檬酸分泌、抗氧化系统、转录因子（Gm-WRKY58和Gm-NPR1）和ABC转运体（Gm-STAR1和Gm-PDR12）基因表达的角度深入探讨外源SA对大豆耐铝性的调控机制,得到如下主要研究结果。1.水杨酸对大豆耐铝性的调控作用外源SA缓解Al对根伸长的抑制作用,且存在浓度依赖及“低促高抑”效应,低浓度（10μmmol/L）SA处理能显著缓解Al对根伸长的抑制,降低Al在根尖中的积累。外源供给SA能快速被根尖吸收,同时大豆内源SA能响应外源Al胁迫与SA处理,内源自由态SA含量在Al胁迫处理4 h达到最高,结合态SA（SAG）含量随Al处理时间的延长而显著增加。SA生物合成抑制剂多效挫（PAC）能抑制Al诱导自由态SA的产生,但对SAG没有影响。这说明外源SA在缓解大豆Al毒害过程中起作用,SA很可能作为Al胁迫的早期信号分子调控大豆耐Al性。2.水杨酸对铝胁迫诱导大豆根系柠檬酸分泌的调控作用Al胁迫下植物根系分泌有机酸是植物重要的抗Al机制之一。目前关于SA是如何促进Al胁迫下柠檬酸分泌的调控机制尚不清楚。本文试图从顺乌头酸酶（ACO）和柠檬酸转运体（MATE）的角度来阐明SA与Al胁迫诱导大豆根系柠檬酸分泌的关系。Al胁迫条件下,外源SA显著提高了Al诱导大豆根系柠檬酸的分泌,PAC不但降低了Al诱导柠檬酸的分泌,且能够抑制自由态SA的产生,表明内源SA对柠檬酸分泌起调控作用。Al和SA共处理与单独Al处理相比进一步降低线粒体ACO的活性,但各处理在不同时间点（2、4、9、12h）对ACO基因的表达差异并不显著,说明ACO很可能在蛋白水平上受到调控;Al和SA共处理与单独Al处理相比提高了大豆根尖柠檬酸转运体Gm-MATE1基因的转录表达,然而Al胁迫条件下外源SA对大豆根尖Gm-MATE1基因的表达和Al诱导柠檬酸分泌之间并不呈线性关系,说明Gm-MATE1基因的表达很可能是柠檬酸分泌的一个前提。以上试验结果表明,Al胁迫条件下SA在柠檬酸的代谢和运输过程中起着至关重要的作用。3.水杨酸对铝诱导大豆根尖氧化胁迫的调控作用Al能诱导活性氧（ROS）的产生,而ROS的产生和清除可以通过抗氧化系统相关酶来控制。近年来的诸多研究结果表明,SA在调控受胁迫的植物体内氧化还原内稳态上起了十分重要的作用。为了进一步探讨SA的效果,本文对抗氧化系统的相关生理指标进行了测定。结果表明,Al胁迫条件下,通过内源SA的快速应答,可引起大豆根尖H2O2水平发生显著变化。外源SA能迅速激活H2O2且在6h达到峰值,随着处理时间的延长（9、12h）,SA反而降低了Al诱导H2O2的积累。说明外源SA增强大豆抗Al胁迫能力可能与过氧化氢（H2O2）的变化存在一定的联系,且Al胁迫条件下SA很可能激活了H2O2的信号转导途径。SA通过调控H2O2代谢相关酶如SOD、CAT、APX的活性,使大豆根尖H2O2含量维持在一定水平,进而缓解Al诱导的氧化胁迫伤害。外源SA降低了Al诱导大豆根尖质膜过氧化产物丙二醛（MDA）和超氧阴离子(O2·–)的累积。上述试验结果表明,SA也可以通过对抗氧化系统的调控进一步缓解Al毒害。4.水杨酸对铝诱导转录因子Gm-WRKY58、Gm-NPR1及ABC转运体Gm-STAR1、Gm-PDR12基因表达的影响已有证据表明,在植物响应胁迫的过程中SA能有效地调控转录因子WRKY和NPR1基因的表达。ABC转运体基因编码膜结合蛋白,是目前已知功能最广泛的超蛋白家族之一。ABC转运体不仅涉及激素、脂类、金属、次生代谢物以及异生物质的运输,而且对离子通道的调控也起着十分重要的作用。本试验结合前期大豆在铝胁迫下基因芯片的分析结果,利用实时荧光定量PCR技术进行分析,结果表明,单独Al处理均显著增加了大豆根尖Gm-WRKY58、Gm-NPR1、Gm-STAR1、Gm-PDR12基因的相对表达水平;而与单独Al处理相比,外源SA分别不同程度地增加了Al诱导的这些基因在根尖的相对表达。表明,转录因子Gm-WRKY58、Gm-NPR1以及ABC转运体Gm-STAR1、Gm-PDR12可能在SA调控的大豆根尖Al胁迫响应过程中起到一定的作用。

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ABSTRACT

第1章文献综述

1.1 酸性土壤和铝毒害

1.1.1 植物铝毒害症状

1.1.2 植物铝毒害机制

1.2 植物耐铝的外部排斥机制

1.2.1 有机酸分泌作为一个重要的耐铝机制

1.2.2 有机酸分泌的调控机制

1.2.3 有机酸代谢在有机酸分泌中的作用

1.2.4 其他耐铝机制

1.3 植物耐铝的内部忍受机制

1.3.1 铝的吸收和运输

1.3.2 有机酸内部解铝毒

1.4 水杨酸在植物体内的作用

1.4.1 水杨酸的生物合成和代谢

1.4.2 水杨酸与生物胁迫

1.4.3 水杨酸与非生物胁迫

1.5 研究目的和意义

第2章水杨酸对大豆耐铝性的调控作用

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 试验材料

2.2.2 植物培养

2.2.3 试验处理与方法

2.2.4 数据统计分析

2.3 结果与分析

2.3.1 铝胁迫下外源SA和PAC对大豆根伸长速率的影响

2.3.2 铝胁迫下外源SA对根尖铝含量的影响

2.3.3 铝胁迫下外源SA和PAC对大豆根尖内源自由态/结合态SA含量的影响

2.4 讨论

2.4.1 铝胁迫下SA对大豆根伸长和根尖铝含量的影响

2.4.2 铝胁迫对大豆内源SA含量的影响

2.5 小结

第3章水杨酸对铝诱导大豆根系柠檬酸分泌的调控作用

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 试验材料

3.2.2 植物培养

3.2.3 试验处理与方法

3.3 结果与分析

3.3.1 外源SA对铝胁迫诱导柠檬酸分泌的影响

3.3.2 铝胁迫下外源SA对柠檬酸含量的影响

3.3.3 铝胁迫下外源SA对大豆根尖线粒体ACO活性及其基因表达的影响

3.3.4 铝胁迫下外源SA对大豆根尖柠檬酸转运体基因Gm-MATE1基因表达的影响

3.4 讨论

3.5 小结

第4章水杨酸对铝诱导大豆根尖氧化胁迫的调控作用

4.1 引言

4.2 材料和方法

4.2.1 试验材料

4.2.2 植物培养

4.2.3 试验处理与方法

4.3 结果与分析

4.3.1 铝胁迫下外源SA对大豆根伸长和根尖MDA含量的影响

2^·-产生速率和H₂O₂积累的影响'>4.3.2 外源SA对铝诱导大豆根尖O₂^·-产生速率和H₂O₂积累的影响

4.3.3 外源SA对铝胁迫下大豆根尖抗氧化系统酶活性的影响

4.3.4 铝胁迫对大豆根尖内源总SA含量的影响

4.4 讨论

4.5 小结

第5章水杨酸对铝诱导转录因子Gm-WRKY58、Gm-NPR1及ABC转运体Gm-STAR1、Gm-PDR12基因表达的影响

5.1 引言

5.2 材料和方法

5.2.1 试验材料

5.2.2 植物培养

5.2.3 试验处理与方法

5.3 结果与分析

5.3.1 外源SA对铝胁迫诱导Gm-WRKY58基因表达的影响

5.3.2 外源SA对铝胁迫诱导Gm-NPR1基因表达的影响

5.3.3 外源SA对铝胁迫诱导Gm-STAR1基因表达的影响

5.3.4 外源SA对铝胁迫诱导Gm-PDR12基因表达的影响

5.4 讨论

5.5 小结

第6章研究总结和展望

参考文献

作者简介

在读博士期间的主要研究成果及参与的科研工作

致谢

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