二斑叶螨体内噬菌体WO、Wolbachia和寄主三者关系的研究

论文摘要

Wolbachia是母系遗传的胞内共生菌,在节肢动物中广泛分布,能够调控宿主的生殖方式,包括胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility, CI）,诱导产雌孤雌生殖（parthenogenesis inducing, PI）,诱导雌性化（feminization）和杀雄（male-killing）。其中,最常见的是CI,即在同一物种里,感染Wolbachia的雄虫与未感染Wolbachia的雌虫交配（unidirectional CI,单向胞质不亲和）或者感染不同株系Wolbachia的雌雄个体交配（bidirectional CI,双向胞质不亲和）,结果往往表现为后代胚死亡和/或性比偏重雄性。在研究Wolbachia引起的生殖异常的机理时,发现在Wolbachia基因组上的自由移动因子的数目非常多。随着研究的深入,已证明Wolbachia内存在噬菌体,被命名为WO,并认为噬菌体WO可能是Wolbachia进行遗传调控的一种潜在的转化工具。通过建立系统发育树,发现噬菌体WO与生殖异常现象之间没有系统进化上的一致性,说明WO并没有直接作用于寄主的生殖异常现象。后来,许多研究证明,噬菌体WO密度与Wolbachia密度之间呈负相关关系,并且Wolbachia密度与CI强度呈正相关关系。基于此,提出了“噬菌体密度模型”。但随着研究的深入,这种模型的普遍性开始遭到质疑。在受到外界条件的刺激下,噬菌体WO可能会转变生活史或者编码一些对Wolbachia或者寄主有辅助作用的蛋白质。这些外界条件主要包括温度、昆虫寄主的日龄、昆虫寄主的基因型以及同个个体内的其它共生菌等。本研究检测并分析了二斑叶螨Tetranychus urticae Koch（红色型）20个地理种群中的噬菌体WO和Wolbachia的感染情况,并从温度、日龄、同个个体内的另一种共生菌Cardinium这三个外界影响因子的角度研究分析二斑叶螨、Wolbachia和噬菌体WO这三者之间的动态变化关系。本研究的主要内容以及取得的初步研究成果如下：1.20个地理种群中所有的种群都感染Wolbachia,但只有30%（6/20）种群的Wolbachia携带噬菌体WO。进一步对携带噬菌体WO的6个地理种群感染的Wolbachia的wsp基因和噬菌体WO的orf7基因进行测序并比对分析,结果发现：共有四种不同的wsp基因序列,分别属于B组Wolbachia的Con和Ori亚组；两种不同的orfZ基因序列相差16 bp,分别为WOwUrt1 （HM623911）和WOwUrt2 （HM623912）.Wolbachia和噬菌体WO之间没有协同进化的对应关系,而且两种Wolbachia被同一种噬菌体WO所侵染,由此我们推断,在感染二斑叶螨的Wolbachia中可能存在噬菌体WO的水平转移。同时,通过对两种不同的orf7基因序列进行系统发育分析,发现这两种噬菌体WO在进化系统中的地位都属于第Ⅱ组,为进一步研究Wolbachia和噬菌体WO之间的相互关系打下坚实基础。2.通过设置不同的温度梯度（19℃,22℃,25℃,28℃和31℃）,研究噬菌体WO的量、Wolbachia的量、寄主表现的CI强度在不同温度梯度下的动态关系。本研究选取感染不同Wolbachia株系但携带同一噬菌体的二斑叶螨（江苏镇江种群（ZJ）和山西运城种群（YC））作为供试材料,结果表明：极端温度可能将原本为溶源性的噬菌体转化为裂解性的噬菌体,间接改变了三者之间的关系。3.通过观察8个不同日龄雄螨体内的Wolbachia和噬菌体WO量,研究日龄对Wolbachia和噬菌体WO量的影响。结果表明：二斑叶螨雄螨体内的Wolbachia和噬菌体WO都随着日龄的增长而增长,当噬菌体WO增长到一定值（1.4×105,不同寄主的值不同）时会转化为裂解性的噬菌体,并表现为与Wolbachia的量呈负相关关系。4.通过定量PCR检测二斑叶螨江苏镇江种群的双感染Wolbachia和Cardinium品系（W+C+）和单感染Wolbachia品系（W+C-）中Wolbachia和噬菌体wO的量,研究Cardinium对Wolbachia和噬菌体WO的量的影响。结果表明：Cardinium对Wolbachia和噬菌体WO量的影响可能与性别相关。雌螨中的Cardinium促进Wolbachia和噬菌体WO量的增长,雄螨中的Cardinium却通过促进噬菌体WO量的增长从而减少Wolbachia的量。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 Wolbachia的研究进展
• 1.1 Wolbachia的分布与系统分化
• 1.2 Wolbachia的传播特性
• 1.3 Wolbachia的基因组
• 1.4 Wolbachia对宿主生殖活动的调控
• 1.5 Wolbachia的应用前景
• 2 噬菌体WO的研究进展
• 2.1 噬菌体WO的形态与分布
• 2.2 噬菌体WO的多样性
• 2.3 噬菌体WO的传播特性
• 2.4 噬菌体WO的基因组
• 2.5 噬菌体WO的生活史
• 3 Wolbachia、WO及寄主三者关系的研究进展
• 3.1 Wolbachia和CI的关系
• 3.2 噬菌体WO与Wolbachia的关系
• 4 实时荧光定量PCR技术及其在共生菌研究领域的应用
• 4.1 实时荧光定量PCR技术的发展
• 4.2 实时荧光定量PCR原理
• 4.3 实时荧光定量PCR的应用方法
• 4.4 实时荧光定量PCR在病原微生物检测上的应用
• 第二章 二斑叶螨中Wolbachia和噬菌体WO协同进化关系的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 二斑叶螨总DNA的提取
• 1.3 PCR扩增
• 1.4 PCR产物纯化
• 1.5 连接反应和转化
• 1.6 质粒的提取
• 1.7 测序
• 1.8 序列分析
• 2 结果
• 2.1 Wolbachia和噬菌体WO在二斑叶螨不同种群中的感染情况
• 2.2 Wolbachia和噬菌体WO的协同进化关系
• 2.3 噬菌体WO的系统发育分析
• 3 讨论
• 第三章 温度对噬菌体WO、Wolbachia和寄主三者关系影响的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 感染噬菌体WO的品系的筛选
• 1.3 二斑叶螨总DNA的提取
• 1.4 标准曲线的制定
• 1.5 温度对WO、Wolbachia和寄主三者关系的影响
• 2 实验结果
• 2.1 标准曲线的制定
• 2.2 温度对二斑叶螨江苏镇江种群中Wolbachia和噬菌体WO的影响
• 2.3 温度对二斑叶螨山西运城种群中Wolbachia和噬菌体WO的影响
• 2.4 Wolbachia和噬菌体WO量的变化对CI强度的影响
• 3 讨论
• 第四章 日龄对雄螨体内Wolbachia和噬菌体WO影响的研究
• 1 料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 感染噬菌体WO的品系的筛选
• 1.3 二斑叶螨雄螨总DNA的提取
• 1.4 标准曲线的制定
• 1.5 不同日龄雄螨体内Wolbachia和噬菌体WO量的测定
• 2 实验结果
• 2.1 不同日龄的二斑叶螨江苏镇江种群中Wolbachia和噬菌体WO的量
• 2.2 不同日龄的二斑叶螨山西运城种群中Wolbachia和噬菌体WO的量
• 3 讨论
• 第五章 Cardinium对Wolbachia和噬菌体WO的影响的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.2 感染噬菌体WO的品系的筛选
• 1.3 二斑叶螨总DNA的提取
• 1.4 标准曲线的制定
• 1.5 Cardinium对Wolbachia和噬菌体WO的量的影响
• 2 实验结果
• 2.1 Cardinium对Wolbachia和噬菌体WO的量的影响
• 3 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 学术论文发表情况
• 致谢