Bacillus sp. G3葡萄糖脱氢酶基因的克隆、表达及其酶性质研究

论文摘要

葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase,GlcDH,EC 1.1.1.47）,是短链乙醇脱氢酶家族的一员,由4个相同的亚基（约30 kD）组成,在辅酶NAD（P）+存在时能够催化β-D-葡萄糖转化成D-葡萄糖酸-δ-内酯,该酶是芽孢杆菌生孢阶段的关键酶。近年来,GlcDH已经广泛研究并应用于很多领域,可用于生物燃料电池,临床检测血糖水平的生物反应器,及大规模手性合成中的辅酶再生系统。目前主要从动物肝脏提取,以及由芽孢杆菌发酵而来,来源受到限制。国内GlcDH主要依靠进口。本论文由葡萄糖脱氢酶的克隆入手,通过简并PCR和反向PCR进行基因克隆,从实验室保存的一株芽孢杆菌Bacillus sp.G3中分离克隆到了一条葡萄糖脱氢酶基因,构建葡萄糖脱氢酶重组表达菌株,通过诱导表达和纯化,获得重组酶,进而研究该菌株葡萄糖脱氢酶性质。本论文的主要研究成果如下:（1）从Bacillus sp.G3菌株中克隆出葡萄糖脱氢酶基因并测序,得到786 bp的片段（登录号:GQ40283）,编码261个氨基酸残基序列。（2）成功进行基因克隆,与质粒pET-28a（+）连接,构建葡萄糖脱氢酶重组质粒pET-28a-gdh,在IPTG诱导下,在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达。（3）对重组酶进行Ni-NTA-resin亲和柱纯化,获得了高浓度高纯度的酶液,比活达371.9 U/mg,在SDS-PAGE中28 kDa处显示单一的条带。（4）研究重组酶的各项性质,结果发现:重组酶的最适反应pH值为9.0,酶的最适反应温度为40℃;25℃条件下,在pH低于8.0的缓冲液中处理60 min后残余酶活力基本在70%以上,而pH 6～7.5最稳定,没有酶活的丧失;在pH 8.0的磷酸盐缓冲液中不同温度处理30 min后,测定残余酶活力,结果发现重组酶在40℃以下稳定;该酶拥有一个比较宽的底物谱,尤其对D-半乳糖和麦芽糖,相较于葡萄糖,相对酶活分别达到22%和13%。酶的动力学常数Km（葡萄糖）=31.8 mM,kcat（葡萄糖）=23 s-1,Kcat/Km（葡萄糖）=0.73 mM-1s-1;Km（NAD+）=0.210mM,kcat（NAD+）=144 s-1,Kcat/Km（NAD+）=687.5 mM-1s-1;Km（NADP+）=0.0095 mM,kcat（NADP+）=33.8 s-1,Kcat/Km（NADP+）=3687 mM-1s-1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 葡萄糖脱氢酶的种类及产葡萄糖脱氢酶的微生物
• +依赖的葡萄糖脱氢酶'>2 源于Bacillus sp.的NAD（P）⁺依赖的葡萄糖脱氢酶
• 2.1 葡萄糖脱氢酶在芽孢杆菌中的作用
• 2.2 葡萄糖脱氢酶的酶学研究
• 2.3 葡萄糖脱氢酶的分子生物学研究
• 2.4 葡萄糖脱氢酶的结构与功能的关系
• 3 葡萄糖脱氢酶的应用
• 3.1 生物燃料电池
• 3.2 临床检测
• 3.3 辅酶再生系统
• 4 研究策略
• 4.1 简并PCR
• 4.2 反向PCR
• 5 本研究的目的及内容
• 第二章 芽孢杆菌Bacillus sp.G3葡萄糖脱氢酶基因的克隆、测序与表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和载体
• 2.1.2 工具酶及试剂盒
• 2.1.3 其它试剂
• 2.1.4 常用培养基和缓冲液
• 2.1.5 常用仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 Bacillus sp.G3基因组DNA的提取
• 2.2.2 Bacillus sp.G3葡萄糖脱氢酶基因的克隆和测序
• 2.2.2.1 基因克隆策略
• 2.2.2.2 保守区基因序列的PCR扩增
• 2.2.2.3 侧翼序列的PCR扩增
• 2.2.2.4 PCR产物测序及序列分析
• 2.2.2.5 扩增葡萄糖脱氢酶基因序列
• 2.2.3 重组质粒的构建
• 2.2.3.1 质粒pET-28a（+）的提取
• 2.2.3.2 PCR产物及质粒的酶切
• 2.2.3.3 酶切产物电泳并割胶回收
• 2.2.3.4 外源DNA与质粒的连接反应
• 2.2.3.4.1 克隆载体pMD19-T
• 2.2.3.4.2 表达载体pET-28 a（+）
• 2.2.4 重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
• 2.2.4.1 感受态细胞的制备
• 2.2.4.2 重组质粒的转化
• 2.2.5 转化子的挑选及鉴定
• 2.2.6 工程菌的诱导表达
• 2.2.7 SDS-PAGE分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 Bacillus sp.G3 GlcDH基因的扩增
• 2.3.2 重组表达载体pET-28a-gdh的构建
• 2.3.3 重组表达载体pET-28a-gdh的诱导表达
• 2.4 结论
• 第三章 重组葡萄糖脱氢酶的纯化及其性质研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 材料及试剂
• 3.1.2 培养基及缓冲液
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 酶活测定
• 3.3 方法
• 3.3.1 菌体的大量培养
• 3.3.2 重组酶的纯化
• 3.3.2.1 粗酶液的制备
• 3.3.2.2 Ni-NTA亲和柱的清洗与平衡
• 3.3.2.3 Ni-NTA亲和柱分离纯化重组酶
• 3.3.3 重组葡萄糖脱氢酶性质的研究
• 3.3.3.1 酶分子量的测定
• 3.3.3.2 温度和pH对酶活性的影响
• 3.3.3.3 温度和pH对酶稳定性的影响
• 3.3.3.4 酶的底物特异性
• 3.3.3.5 酶促反应动力学研究
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 葡萄糖脱氢酶的纯化结果
• 3.4.2 酶的最适反应温度和最适反应pH
• 3.4.3 酶的热稳定性和pH稳定性
• 3.4.4 酶的底物特异性
• 3.4.5 酶促反应动力学研究
• 3.5 结论
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 论文的创新及意义
• 4.3 本文工作的不足及展望
• 参考文献
• 致谢