比较槲皮素和裂叶苣荬菜内酯诱导Jurkat细胞凋亡的研究

论文摘要

苣荬菜是一种纯天然绿色食品,具有较强的营养和保健价值。研究证实,苣荬菜醇提物可以诱导急性T淋巴细胞性白血病细胞Jurkat发生凋亡,并且利用GC- MS法确定了醇提物中裂叶苣荬菜内酯的含量。但是醇提物成分复杂,单一活性成分的药理作用和抗癌机制尚未明确。本研究旨在以苣荬菜醇提物中槲皮素和裂叶苣荬菜内酯的含量为依据,比较研究两者诱导Jurkat细胞凋亡的作用,并初步探索两者启动Jurkat细胞凋亡程序的信号传导通路。为进一步开发苣荬菜中的天然抗肿瘤化合物及其抗癌机制的深入研究提供理论参考。本研究主要包括以下两个方面:第一,通过反相高效液相色谱法测定苣荬菜中的槲皮素含量,为细胞凋亡实验中槲皮素和裂叶苣荬菜内酯的剂量设定提供参考依据。第二,运用改良的MTT法测定槲皮素（Q）和裂叶苣荬菜内酯（S）浓度分别在10μg/mL和20μg/mL时（记为Q10、Q20、S10和S20）诱导Jurkat细胞凋亡的作用,以抑制效果为依据确定两者的作用时间,分别通过Hoechst 33258染色、流式细胞术、罗丹明123染色、Western blot免疫印迹等方法比较研究槲皮素和裂叶苣荬菜内酯诱导急性T淋巴性白血病Jurkat细胞凋亡的作用。本研究主要得到以下结果:⑴高效液相色谱法测定苣荬菜中槲皮素含量的最佳色谱条件为:色谱柱:Hypersil– ODS2 C18柱（250 mm×4.6 mm,5μm）;流动相:甲醇- 0. 1%磷酸水溶液（48︰52, V︰V）;检测波长:360 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃。在此色谱条件下测定苣荬菜中槲皮素的平均含量为0.1169 mg·g -1;⑵改良的MTT法结果表明:相同作用剂量下,槲皮素和裂叶苣荬菜内酯均能抑制急性T淋巴细胞性白血病细胞Jurkat增殖,且槲皮素的抑制作用要强于裂叶苣荬菜内酯。这种增殖抑制作用与作用浓度和作用时间呈现正向相关性。24 h,S20处理组细胞增殖抑制率与对照组相比差异显著（P<0.05）,Q20处理组与对照组相比存在极显著的差异（P<0.01）;48 h,S10, Q10处理组与对照组相比差异显著（P<0.05）,S20, Q20处理组与对照组相比存在极显著的差异（P<0.01）;⑶Hoechst33258染色观察细胞形态学结果显示:槲皮素和裂叶苣荬菜内酯均可使Jurkat细胞呈现典型的凋亡特征,说明两者可以诱导Jurkat细胞凋亡。随着浓度增加,凋亡细胞数逐渐增多;⑷AnnexinⅤ-PI结果进一步证明:不同浓度的槲皮素和裂叶苣荬菜内酯作用Jurkat细胞48 h后均有一定的细胞凋亡作用,其中S10凋亡率为10.40%,Q10凋亡率为12.13%,S20凋亡率为38.20%,Q20凋亡率为41.07%。S10、Q10、S20和Q20处理组的细胞凋亡率显著高于对照组;⑸罗丹明123染色结果显示:Q10、Q20、S10和S20处理Jurkat细胞48后,各处理组的平均荧光强度分别为751.67,681.31,147.98,111.11,与空白对照组相比均存在极显著性差异。同时相同浓度条件下,槲皮素的引起的线粒体膜电位下降作用要强于裂叶苣荬菜内酯;⑹Western Blot结果说明:槲皮素和裂叶苣荬菜内酯可以降低Jurkat细胞中凋亡抑制基因Bcl-2蛋白的表达,Bcl-2蛋白的相对含量随着两者浓度增加而逐渐降低,而且槲皮素的作用要强于裂叶苣荬菜内酯。本研究可以得出以下结论:苣荬菜中的活性成分槲皮素和裂叶苣荬菜内酯含量相近,均可通过抑制凋亡抑制基因Bcl-2蛋白的表达诱导急性T淋巴细胞性白血病细胞Jurkat发生凋亡,并且槲皮素诱导Jurkat细胞凋亡的作用略强于裂叶苣荬菜内酯。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 苣荬菜的研究综述
• 1.1.1 苣荬菜的食用历史
• 1.1.2 苣荬菜的植物学特性
• 1.1.3 苣荬菜的保健功效及药理价值
• 1.1.4 苣荬菜化学成分的研究进展
• 1.2 细胞凋亡概述
• 1.2.1 细胞凋亡基本理论
• 1.2.2 细胞凋亡的相关调控基因
• 1.2.3 细胞凋亡信号转导通路
• 1.3 细胞凋亡与白血病治疗
• 1.3.1 细胞凋亡与白血病的关系
• 1.3.2 凋亡理论治疗白血病的研究进展
• 1.3.3 槲皮素诱导白血病细胞凋亡的研究
• 1.3.4 倍半萜类化合物抗肿瘤作用的研究
• 1.4 研究的目的与意义
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 研究意义
• 1.5 研究的主要内容
• 1.6 课题创新点
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 原料与试剂
• 2.1.2 仪器与设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 苣荬菜中槲皮素的的含量测定
• 2.2.2 Jurkat 细胞培养
• 2.2.3 改良的MTT 法检测细胞增殖抑制作用
• 2.2.4 荧光显微镜检测细胞凋亡
• 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡
• 2.2.6 流式细胞术检测线粒体膜电位
• 2.2.7 Western blot 检测凋亡抑制蛋白表达
• 3 结果与分析
• 3.1 HPLC 法测定苣荬菜中的槲皮素
• 3.1.1 最佳色谱条件
• 3.1.2 标准曲线和线性范围
• 3.1.3 精密度实验
• 3.1.4 稳定性实验
• 3.1.5 重现性实验
• 3.1.6 回收率实验
• 3.1.7 样品测定
• 3.2 苣荬菜中槲皮素和裂叶苣荬菜内酯的含量比较
• 3.3 改良的MTT 法检测细胞增殖抑制作用
• 3.4 Hoechst 33258 染色观察细胞形态学变化
• 3.5 AnnexinⅤ-PI 法检测细胞凋亡率
• 3.6 罗丹明123 染色检测线粒体膜电位变化
• 3.7 Western Blot 法检测Bcl-2 蛋白表达变化
• 4 讨论
• 4.1 测定苣荬菜中槲皮素的方法优化
• 4.1.1 提取方法的确定
• 4.1.2 提取条件的优化
• 4.1.3 色谱条件的选择
• 4.2 改良的MTT 法检测细胞抑制作用
• 4.3 形态学观察细胞凋亡
• 4.4 流式细胞术检测细胞凋亡
• 4.5 流式细胞术检测线粒体膜电位
• 4.6 免疫印迹法检测细胞凋亡
• 4.7 展望
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文