青岛文昌鱼Sox1/2/3-like基因的扩增与表达研究

论文摘要

Sox基因家族是一类SRY（sex determination region of Y chromosome）相关基因构成的基因家族。其产物都具有一个HMG基序保守区。Sox基因在个体发育过程中广泛参与了早期胚胎发育、神经发育等多种发育过程。研究Sox家族基因的功能和特点,对揭示人类性别决定的分子机制、胚胎发育的基因调控以及多种组织、器官的发生、发育过程和调控机制都有十分重要的意义。文昌鱼属于头索动物,是现存的无脊椎和脊椎动物亲缘关系最近的类群。由于其具有脊椎动物的部分形态发育模式、基因没有大量倍增且不太复杂,是研究脊椎动物起源和进化的模式生物。文昌鱼中最早发现的与Sox基因同源的基因是Amphisox1/2/3基因,该基因在佛罗里达文昌鱼中的表达与神经外胚层的发生和神经管的形成密切相关。2005年张伟在青岛文昌鱼中也发现了Sox基因的同源基因,并将其命名为Amphisox1/2/3-Like基因,（GeneBank:AY870807）,该基因在原肠胚中内胚层开始分化时在预定背部表达,随着胚胎的发育,其表达的区域先后出现在神经板、神经管并且与中枢神经系统的发育一致。同时随着中枢神经系统发育的完成,其表达水平也从前向后逐渐下调。Amphisox1/2/3-Like基因的这一时空表达模式说明,它在青岛文昌鱼中与神经系统的发生密切相关。对文昌鱼与脊椎动物一些重要发育相关基因的比较研究揭示,在进化上脊椎动物的神经外胚层和非神经外胚层分化的遗传学机制,出现于文昌鱼与脊椎动物的祖先歧化之前,那么这一基因在神经外胚层中的表达的基因网络究竟保守程度如何至今尚不清楚,因此开展青岛文昌鱼Sox1/2/3-like基因的表达研究具有十分重要的意义。本论文通过从GeneBank中寻找与文昌鱼亲缘关系相近的物种如斑马鱼、柄海鞘等的Sox基因序列,根据这些相近物种Sox基因序列之间的保守序列设计一对特异性引物,利用PCR的方法扩增筛选了青岛文昌鱼的Sox1/2/3-like基因;根据所得到的基因,利用Genome Walking（染色体步移方法）方法获取了已知基因的3,端侧翼序列和5,端侧翼序列;利用PCR的方法标记探针,将已经获得的基因按照实验所需要的探针长度片段标记上地高辛,利用原位杂交技术结合组织学切片技术对该基因进行了组织表达分析;此外,利用免疫电镜技术检测并定位研究了Sox1/2/3-like基因在亚显微水平的表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 Sox 基因家族的特点及其功能
• 1.1 Sox 基因和Sox 基因家族
• 1.2 Sox 基因家族的分类
• 1.3 Sox 基因的特点
• 1.4 Sox 基因的功能
• 1.4.1 Sox 基因与性别决定
• 1.4.2 Sox 基因与神经系统的发育
• 1.4.3 Sox 基因在软骨形成中的作用
• 1.4.4 Sox 基因与血的生成
• 1.4.5 Sox 基因与晶状体的发育
• 1.4.6 Sox 基因在胚胎发育中的作用
• 1.5 Sox 基因的研究前景和意义
• 2 文昌鱼及其Sox 基因研究进展
• 2.1 文昌鱼生物学地位及研究价值
• 2.2 文昌鱼分布和生活条件
• 2.3 文昌鱼研究现状
• 2.4 Sox 基因在文昌鱼中的研究现状
• 3 本实验的研究目的和意义
• 论文正文
• 前言
• 第一章 Sox1/2/3-like 基因的克隆
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物和试剂
• 1.1.2 主要试剂配制
• 1.1.3 主要实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 组织DNA 的提取
• 2 结果和讨论
• 2.1 结果分析
• 2.1.1 电泳结果
• 2.1.2 测序结果
• 2.1.3 数据库序列比对分析结果
• 3 讨论
• 第二章 已知基因的侧翼序列获取
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂的配制
• 2 方法与实验步骤
• 2.1 已知序列的5’端侧翼序列的获取
• 2.1.1 引物设计
• 2.1.2 实验方法
• 2.1.3 实验结果
• 2.1.4 对已经获得的5’端未知序列进行验证
• 2.2 已知序列的3’端侧翼序列的获取
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 实验步骤和方法
• 2.2.3 对已经获得的3’端未知序列进行验证
• 2.2.4 实验结果
• 3 对两端侧翼序列的连续性验证
• 3.1 利用生物信息学的方法对总体序列进行连续性验证
• 3.1.1 3 条序列拼接情况
• 3.1.2 具体拼接过程
• 3.2 利用实验方法进行连续性验证
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 实验步骤和方法
• 3.2.3 5’端未知序列的验证
• 4 讨论
• 第三章 探针标记和基因的组织表达研究
• 1 材料和试剂
• 1.1 文昌鱼
• 1.2 试剂和材料
• 1.2.1 试剂配制
• 1.2.2 玻片处理
• 1.3 主要实验仪器
• 2 方法
• 2.1 PCR 法制备地高辛（DIG）标记Sox1/2/3-like 基因探针
• 2.2 石蜡切片的制备
• 2.3 原位杂交检测Sox1/2/3-like 基因在文昌鱼各组织中的分布
• 2.4 结果分析
• 3 讨论
• 第四章 电镜原位杂交
• 1 材料和试剂
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂的配制
• 2 实验方法和步骤
• 2.1 取材
• 2.2 材料的固定
• 2.3 原位杂交
• 2.4 材料脱水与浸透
• 2.5 材料的包埋与聚合
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 发表文章目录
• 致谢