猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP2原核表达与单克隆抗体的研制

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）属动脉炎病毒科成员,可引起怀孕母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。PRRSV基因组为单股正链RNA,大小约15kb,含有8个开放阅读框（ORFs）。ORF1编码的聚合蛋白裂解产生13个非结构蛋白（NSP1-13）,NSP2有多个B细胞表位,具有较强的免疫原性,病毒感染后能够刺激机体产生特异性抗体。本实验通过基因重组技术将截短修饰过的NSP2基因克隆至原核表达载体中进行表达,表达出的蛋白经过纯化及鉴定后免疫Balb/C小鼠,通过细胞融合技术获得了两株单克隆抗体,主要内容包括:1.PRRSV NSP2基因在大肠杆菌中的表达:以含有PRRSV NSP2基因的pET-NSP2重组质粒为模板,参照已发表的PRRSV基因组序列,设计一对PCR引物,并在其上下游分别添加EcoRI和NotI酶切位点。获得的PCR产物用EcoRI和NotI酶切后与经同样处理的pGEX-6p-1原核表达载体质粒连接,转化DH5α细胞后挑取阳性克隆。经酶切鉴定和测序验证后,转化至E.coli BL21中,用0.6mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）于37℃诱导表达4b后,取细菌茵体用SDS-PAGE分析。结果表明,NSP2在大肠杆菌中得到表达,重组蛋白大小约为50kDa。将表达出来的NSP2蛋白用亲和层析法进行纯化,用猪抗PRRSV血清抗体进行Westernblot鉴定,结果表明,融合表达的GST-tNSP2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别。2.PRRSV NSP2蛋白单克隆抗体的制备:取纯化的GST-tNSP2蛋白按每只50μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,经皮下多点注射免疫6-8周龄Balb/c小鼠。每间隔2w再用弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白加强免疫2次,并于融合前3d用纯化的GST-tNSP2蛋白免疫1次。取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,融合率达到80%,首次筛选阳性率达60%,经过3次亚克隆,获得2株能稳定分泌抗NSP2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为285、3H3。亚型鉴定结果均为IgG1型,其轻链均为κ链。间接免疫荧光试验证明,285和3H3均能与PRRSV S1毒林产生特异性反应,而不能与SY0608毒株反应。采用间接ELISA法测得285细胞培养上清抗体效价为1:512,腹水效价为1:102400;3H3细胞培养上清为1:640,腹水效价为1:204800。将杂交瘤细胞株连续培养60d,传代20次,分别取第5、10、20代的培养上清,检测其ELISA抗体效价,结果基本一致。综上所述,本试验通过原核表达技术和细胞融合技术获得了两株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株285、3H3,为PRRSV分离株的鉴定及NSP2功能研究奠定了重要基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒编码蛋白的功能与单克隆抗体研究进展
• 1 病毒基因组及蛋白结构功能
• 1.1 ORF1编码蛋白
• 1.2 GP2蛋白
• 1.3 GP3蛋白
• 1.4 GP4蛋白
• 1.5 GP5蛋白
• 1.6 M蛋白
• 1.7 N蛋白
• 2 猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体研究进展
• 2.1 N蛋白单抗
• 2.2 M蛋白单抗
• 2.3 GP5单抗
• 2.4 次要结构蛋白单抗
• 2.5 非结构蛋白单克隆抗体
• 参考文献
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白基因片段的克隆、表达与鉴定
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 tNSP2基因的PCR扩增
• 2.2 重组质粒pGEX-6p-1-tNSP2的构建与鉴定
• 2.3 GST-tNSP2重组蛋白的表达
• 2.4 重组蛋白表达形式的鉴定
• 2.5 重组蛋白的纯化
• 2.6 Western blot结果
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2蛋白单克隆抗体的研制
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 间接ELISA法检测多抗的效价
• 2.2 杂交瘤细胞株的建立
• 2.3 单克隆抗体的鉴定
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 攻读学位期间发表的论文
• 附录