论文摘要
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是由CD4+T淋巴细胞介导的以炎性脱髓鞘为特征的动物模型。目前认为,在EAE的发病过程中轴索损害和神经元的凋亡也同样起着重要的作用,且与进行性的神经功能障碍密切相关。NF-κB是一种重要的转录因子,在多种神经系统疾病中调控神经元的凋亡。糖皮质激素对EAE有治疗作用,但其副作用限制了临床应用。我们以前的研究认为黄芩苷可通过抑制NF-κB的活性减少细胞因子的产生而对感染性脑水肿有保护作用,并可以抑制缺血缺氧性脑损伤中神经元的凋亡。本实验通过观察黄芩苷及地塞米松预处理对EAE大鼠神经系统内NF-κB的激活与轴索损害和神经元凋亡之间的关系,探讨黄芩苷预处理对EAE是否具有保护作用及其机制。实验分以下两个部分:一、黄芩苷预处理对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠轴索的保护作用目的:观察黄芩苷预处理对EAE大鼠轴索损伤及神经功能障碍的影响。方法:健康6~8周龄的Wistar大鼠96只,随机分为4组:①空白对照组(CON,n=24);②实验性自身免疫性脑脊髓炎组(EAE,n=24);③地塞米松预处理组(DXM,n=24);④黄芩苷预处理组(BAC;n=24)。DXM组在免疫当日开始予以地塞米松0.5mg/200g×7天,腹腔注射;BAC组在免疫当日开始予以2%黄芩苷溶液200mg/kg×7天,腹腔注射;EAE组和CON组每日以同体积的生理盐水腹腔注射。观察各组动物临床发病率、体重变化、神经功能评分等。分别与免疫后第7天、第14天、第21天处死大鼠,留取脊髓(腰膨大处)、脑干,部分置于液氮内保存,部分行石蜡包埋、病理切片,比较各组HE染色的病灶数、髓鞘染色,免疫组化检测NF-200KDa密度变化。结果:①行为学改变:CON组大鼠无发病,DXM组和BAC组发病率分别为56.25%(9/16),50%(8/16)较EAE组87.50%(14/16)明显降低,差异有显著性意义(P<0.01)。CON组大鼠体重呈明显上升趋势。EAE组大鼠于发病前1~2天体重开始下降,发病高峰期体重下降最明显,疾病缓解后体重开始上升。在第7天、14天、21天三个时间点上体重与CON组相比差异有显著性意义(P<0.01)。DXM组大鼠体重下降,与EAE组比较差异无显著性意义(P>0.05)。黄芩苷组各时间点体重缓慢上升,与EAE相比差异有显著性意义(P<0.01)。EAE组首发症状时间为8.75±0.25天,DXM组和BAC组首发症状时间分别为12.8±0.29天和13.06±0.23天,较EAE组发病延迟,差异有显著性意义(P<0.01)。DXM组、BAC组最高神经功能评分分别为1.56±0.34,1.46±0.20与EAE组(2.78±0.31)相比差异有显著性意义(P<0.01)。②病理改变:EAE组炎性病灶数为8.21±3.92,DXM组、BAC组脊髓内炎性病灶数分别为3.00±1.83和4.65±1.24,与EAE组比较明显减少,差异有显著性意义(P<0.05)。EAE组各时间点轴索密度较CON组明显减低,DXM组、BAC组轴索密度较EAE组有所增加,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:黄芩苷预处理能明显减少炎症细胞浸润,保护轴索,改善EAE大鼠症状,降低神经功能评分。二、黄芩苷预处理对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠神经元凋亡的影响及机制研究目的:观察黄芩苷预处理对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠神经元凋亡及NF-κBp65蛋白及mRNA表达的影响。探讨神经元凋亡的调节机制。方法:Wistar大鼠随机分组和处理方法同第一部分。取脊髓组织50mg提取总RNA,行RT-PCR,检测NF-κBp65 mRNA的表达。石蜡切片行免疫组化染色,TUNEL法检测神经元的凋亡。结果:①神经元凋亡指数(AI):CON组偶见细胞凋亡,EAE组三个时间点AI分别为23.25±1.82,63.00±4.66和31.50±3.63,较CON组明显增高,差异有显著性意义(P<0.01);DXM组AI值分别为16.75±1.28,33.88±1.46和22.00±2.45,BAC组AI值分别为15.25±1.67,34.25±3.28和21.88±3.09,两组AI值与EAE组相比明显降低,差异有显著性意义(P<0.01)。②神经元NF-κBp65蛋白表达检测:CON组脊髓偶见NF-κBp65核移位的阳性神经元。EAE组免疫七天后脊髓内神经元NF-κBp65阳性率开始增加为19.13±2.53,第14天增加更明显为50.50±8.07,21天阳性率减少为33.50±6.16,各时间点与CON组相比明显增加,差异有显著性意义(P<0.01)。三个时间点阳性率DXM组为13.12±1.72,28.55±2.49和18.00±3.30,BAC组为14.00±1.51,32.75±3.45和17.37±2.44,两组与EAE相比明显减少,差异有显著性意义(P<0.05)。③大鼠脊髓NF-κBp65mRNA检测结果:CON组NF-κBp65 cDNA灰度比为0.55±0.065、0.53±0.083、0.54±0.082,各时间点变化不明显。EAE组各时间点灰度比分别为0.78±0.062、0.98±0.105、0.83±0.071与CON组比较明显增高,差异有显著性意义(P<0.01)。DXM、BAC组各时间点灰度比分别为(0.67±0.040,0.84±0.051和0.68±0.065),(0.65±0.038,0.82±0.103和0.70±0.069),两组与EAE组比较明显下降,差异有显著性意义(P<0.01)。结论:黄芩苷预处理能明显抑制NF-κBp65的活化,减少神经元的凋亡,达到神经保护的目的。
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标签:凋亡论文; 黄芩苷论文; 实验性自身免疫性脑脊髓炎论文; 核因子论文;