利用杆状病毒系统规模化生产rAAV1的研究

论文摘要

临床研究及实验表明,基因治疗的关键在于载体的选择。发展至今,不同时期已有多种不同的载体应用于基因治疗中,如逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、慢病毒载体、腺病毒及腺相关病毒载体等。各种载体都具有各自的优点及缺陷。腺病毒载体的结构及功能研究较为清楚,因其致病原性低,宿主范围广泛,包装生产简单,可同时表达多个基因等优势在基因治疗中被广泛应用;但是腺病毒同样存在靶向性差,表达外源基因时间短,容易引起较为强烈的免疫反应等诸多缺陷。目前国际上较为公认的腺相关病毒（AAV）载体可以在一定程度上弥补这些不足。AAV对人体免疫原性低,几乎无致病性,可介导目的基因长效表达,并且宿主范围极为广泛,能感染不同细胞周期的多种类型细胞。已发现的AAV血清型至少有150多种,不同血清型的AAV可以靶向不同的细胞和组织,进一步扩大了AAV的应用范围。AAV1因其可以高效靶向骨骼肌,携带外源基因应用于临床研究和治疗更为安全,已经越来越多的被作为基因治疗载体用于多种疾病的治疗。但是临床研究对AAV1的需求量极高,一般滴度要达到1017VG/ml。传统的质粒转染生产方式所得到的AAV容易被腺病毒污染,并且耗时耗力,过程繁琐,实际操作很难达到临床需要的用量。本研究采用二杆状病毒-昆虫细胞生产系统,期望探索出一套rAAV1规模化包装生产的稳定方法。杆状病毒能够为AAV的复制包装提供必要的辅助元件,并且杆状病毒不会像腺病毒和单纯疱疹病毒一样对人体产生毒性,又借助对昆虫细胞Sf9的感染性,在昆虫细胞中悬浮生产重组AAV载体,是一种较为理想且能满足临床需求的新型重组AAV生产方式。本研究首先构建完成了三个携带了AAV包装所需的顺式和反式作用元件的重组pFastBacDual质粒:pFBD-AAV1RepiCapi和pFBD-AAV1RFP、pFBD–AAV1AT7（Avastin）;利用重组pFastBacDual质粒转化DH10TMBac感受态菌株,获得Bac-AAV1RepiCapi和Bac-AAV1RFP、Bac-AAV1AT7 （Avastin）,滴度分别为5.42×108VG/ml、2.63×108VG/ml、5.95×1012VG/ml;采取二杆状病毒系统成功包装出重组AAV病毒rAAV1RFP、rAAV1- AT7（Avastin）,rAAV1-RFP。100ml锥形瓶中包装出的rAAV1-RFP病毒产量为3.7×1013vg,可达35TU/Cell,生产能力较强;利用rAAV1-RFP感染细胞,荧光显微镜下观察红色荧光效果理想;运用ELISA手段检测rAAV1-AT7（Avastin）不同时间抗体表达量,抗体均有所表达,说明本研究已经探索出一套利用二杆状病毒系统包装生产rAAV1的方法,包装出的病毒均具有生物学活性,并能够实现外源基因的体外表达,后续进一步放大生产规模,即可生产出满足临床需求的rAAV1。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一部分 引言
• 第一章 基因治疗研究现状
• 1 基因治疗的概念及发展历程
• 2 基因传递系统
• 2.1 非病毒传递系统
• 2.2 病毒传递系统
• 2.2.1 逆转录病毒系统
• 2.2.2 单纯疱疹病毒系统
• 2.2.3 痘苗病毒载体
• 2.2.4 腺病毒载体
• 2.2.5 腺相关病毒系统
• 第二章 腺相关病毒
• 1 腺相关病毒生物学特性
• 2 腺相关病毒血清型及其应用
• 2.1 腺相关病毒血清型概述
• 2.2 腺相关病毒在临床上的应用
• 2.3 AAV1 的应用及优势
• 2.4 rAAV的制备原理
• 第三章 腺相关病毒的生产
• 1 传统的AAV生产方式概述
• 1.1 质粒转染辅助腺病毒感染的方式
• 1.2 全质粒转染方式
• 1.3 稳定细胞系生产方式
• 2 杆状病毒-昆虫细胞生产系统
• 第二部分 研究论文
• 第一章 实验设计方案及课题内容
• 1 本课题研究目的和意义
• 2 课题出发点
• 3 实验内容
• 第二章 重组pFastBacDual载体的构建及菌内转座重组生产重组Bacmid
• 1 实验器材
• 1.1 材料
• 1.2 仪器和设备
• 1.3 试剂及试剂盒
• 1.4 主要试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 重组pFBD载体构建
• 2.1.1 pFBD-AAV1RepiCapi载体的构建
• 2.1.2 PABV359-RFP的构建
• 2.1.3 PABV359-AT7 的构建
• TM中的转座重组及重组Bacmid的提取'>2.2 重组pFBD载体在DH108ac^TM中的转座重组及重组Bacmid的提取
• 2.2.1 重组pFBD载体在DH108ac?中的转座重组
• 2.2.2 重组Bacmid的大量抽提及PCR鉴定
• 3 结果
• 3.1 载体构建PCR及酶切鉴定结果
• 4 讨论
• 第三章 重组杆状病毒的包装及相关数据检测
• 1 实验器材
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器和设备
• 1.3 荧光定量PCR引物
• 2 实验方法及结果
• 2.1 Sf9 细胞的培养
• 2.2 重组杆状病毒的包装
• 2.3 重组杆状病毒的扩增
• 2.4 重组杆状病毒DNA的提取
• 2.5 荧光定量PCR测定重组杆状病毒的滴度
• 2.5.1 Bac-AAV1RepiCapi的滴度测定
• 2.5.2 Bac-AAV1-AT7（Avastin）杆状病毒滴度测定
• 2.5.3 Bac-AAV1-RFP 杆状病毒滴度测定
• 3 讨论
• 第四章 重组AAV的生产、纯化、滴度和活力测定
• 1 实验器材
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器和设备
• 1.3 试剂的配制
• 2 实验方法
• 2.1 Western Blot检测抗体Avastin重轻链的表达
• 2.2 ELISA 方法检测蛋白的表达量
• 2.3 rAAV1-RFP的生产
• 2.3.1 rAAV1-RFP的二杆状病毒包装系统
• 2.4 rAAV1-AT7（Avastin）的包装及纯化
• 2.5 滴度测定
• 2.5.1 rAAV1-RFP基因组滴度测定
• 2.5.2 rAAV1-AT7（Avastin）基因组滴度测定
• 2.6 病毒生产能力的评估
• 2.7 病毒活力的检测
• 2.7.1 重组AAV1 荧光表达量检测
• 2.7.2 重组AAV1 抗体表达量检测
• 2.8 rAAV1 包装条件的优化
• 3 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢