论文摘要
雌激素是维持女性生理和心理健康所必需的内源性活性物质，自绝经期开始至绝经后，伴随着刺激素水平的降低，女性出现一系列的绝经近期、中期和远期的相关疾病。因而，雌激素补充治疗成为女性健康医疗服务的一个重要领域。但是雌激素有促使子宫内膜增生而致癌的不良反应，所以目前主要采用雌、孕激素联合应用的性激素替代疗法（Hormone Replacement Therapy, HRT）。但是HRT仍然存在一些不良作用，孕激素不能完全纠正雌激素的副作用，而且削弱雌激素对心血管的保护作用。新的治疗方案在不断探索中。雷洛昔芬是一种选择性的雌激素受体拮抗剂，对乳腺、子宫组织显示为雌激素的受体拮抗剂，对骨骼和血脂则为雌激素受体的激动剂，对心血管系统目前也发现多种类雌激素的作用。可以推测，两者联用后的有利作用可以得到增强，而二者的副作用则可以相互削减。目前，有关新的HRT方案的研究不多，用雷洛昔芬代替孕激素的方法还没有报道。本文应用雷洛昔芬替代孕激素，辅以阿司匹林，观察其对血管平滑肌细胞的增殖以及ICAM-1、PAI-1、ET-1在血管内皮细胞中的表达的影响，从细胞和分子水平对该方案能否达到预期效果进行深入研究。第一部分阿司匹林抑制血管平滑肌细胞增殖及相关机制[方法]：1．MTT法检测对血管平滑肌增殖的抑制作用将对数生长期的细胞以每孔104个种于96孔板中，待其长至80％融合，换用不含血清和酚红的DMEM培养液培养24小时，使细胞同步于G0期，然后换用2％FCS的DMEM，加入阿司匹林，使终浓度分别为10-4mol／L、10-3mol／L、2×10-3mol／L、5×10-3mol／L四个处理组，并设对照组。培养24小时后，每孔加入MTT（0.5g／L）20ul孵育4小时，吸去上部液体，然后加入二甲基亚砜（DMSO）150ul，轻微震荡10min使沉淀完全溶解，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度。观察阿司匹林对血管平滑肌细胞的增殖的抑制作用。2．免疫细胞化学检测阿司匹林处理后平滑肌细胞中PCNA表达用VSMC制作细胞爬片，将对数生长期细胞以每孔105个接种于6孔板中，盖玻片预先放置在6孔板中，待长至80％融合时用无血清无酚红DMEM静止24小时，换含2％FCS的DMEM，加入阿司匹林，分组同上。24小时后，移去培养液，PBS漂洗3次，4％多聚甲醛固定，PBS洗3次，用试剂盒中的山羊血清室温孵育30min，加一抗置湿盒中4℃孵育12小时，然后按照试剂盒说明书加二抗，显色，复染。在100倍视野下随机选取细胞爬片上不同部位的5个视野，计数阳性细胞。用χ2检验、Fisher’s精确概率法进行统计分析。P＜0.05被认为有显著性差异。3．流式细胞检测阿司匹林作用后血管平滑肌细胞周期变化细胞按105个细胞每孔转入6孔板培养至80％融合，更换为无血清培养基孵育24h使细胞同步，随后将细胞置于含2％FCS培养基中，并加入不同剂量阿司匹林(分组为10-3mol／L、2×10-3mol／L、5×10-3mol／L三个处理组和对照组)，继续孵育24h，收获细胞（约106个），70％乙醇固定，4℃过夜，溴化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测细胞周期。Modtif软件分析细胞周期。4．RT-PCR检测阿司匹林作用后PCNA mRNA表达变化细胞经不同浓度阿司匹林（分组同上）处理24小时后，用Trizol提取总RNA，具体操作步骤按照说明书。用紫外分光光度法测定RNA纯度和浓度。本实验测定PCNA mRNA表达，用β-actin作为内参。按照试剂盒说明书逆转录合成cDNA后，PCNA和β-actin同管在50ul反应体系中进行PCR扩增。PCR产物在含0.5ug／ul EB的1.5％琼脂糖凝胶电泳。应用凝胶成像分析系统（Bio-rad）对条带进行半定量分析，PCNA基因的表达量通过扩增的β-actin的表达进行校正，即以PCNA／β-actin比值作为PCNA基因表达相对水平。统计学处理：每个样本重复测定3次，实验结果以均数±标准差（（?）±s）表示，采用SPSS10.0统计软件包进行配对t检验、方差分析、χ2检验进行统计学处理。[结果]1．MTT实验检测显示阿司匹林能明显抑制血管平滑肌细胞的增殖活性，在各浓度的生长抑制率分别为4.9％、15.5％、16.2％、31.5％。2．免疫细胞化学显示5×10-3mol／L阿司匹林处理组染色较浅，而对照组和10-3mol／L、2×10-3mol／L组染色深。软件检测后结果显示5×10-3mol／L组PCNA表达明显低于正常对照组（P＜0.05），而10-3mol／L、2×10-3mol／L组和对照组间没有明显差异（P＞0.05）。3．流式细胞结果表明5×10-3mol／L阿司匹林处理后，血管平滑肌细胞增殖主要阻滞在S期。4.5×10-3mol／L阿司匹林处理后，血管平滑肌细胞内PCNA mRNA表达较对照组低。而10-3mol／L和2×10-3mol／L浓度和对照组间没有明显差异。[结论]本文证明较高浓度的阿司匹林能抑制血管平滑肌细胞的增殖和核内PCNA的表达，提示这种抑制作用可能是通过抑制PCNA的表达，从而使血管平滑肌细胞的增殖停滞在S期。阿司匹林抑制PCNA表达最早可能在mRNA水平。第二部分单一药物对血管内皮细胞ET-1、PAI-1、ICAM-1基因表达的影响[方法]将对数生长期细胞以每孔105个接种于6孔板中，待其长至70—80％融合，换含1％血清无酚红的培养液培养。加入药物，培养24小时后取出细胞，按Trizol说明书提取RNA，做逆转录PCR，检测雌激素，雷洛昔芬，阿司匹林处理后，ET-1、PAI-1、ICAM-1在内皮细胞中的表达情况。三种药物的实验分组情况分别为：阿司匹林：5×10-3mol／L，2×10-3mol／L，10-3mol／L，对照组雌激素：10-9mol／L，10-8mol／L，10-7mol／L，对照组。雷洛昔芬：10-8mol／L，10-7mol／L，10-6mol／L，对照组[结果]5×10-3mol／L阿司匹林能抑制PAI-1基因表达10-7mol／L和10-6mol／L雌激素可以抑制内皮细胞中ET-1基因的表达10-6mol／L雷洛昔芬可以抑制ICAM-1和ET-1基因的表达[结论]较高浓度的雌激素和雷洛昔芬可以抑制ET-1表达，阿司匹林可以抑制PAI-1表达，而这两个内皮危险因子的抑制作用有利于心血管系统。为雷洛昔芬替代孕激素而和雌激素联用提供理论依据。