论文摘要
血管生成与多种疾病的发生、发展密切相关。炎症是导致血管异常增生的关键因素,而Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）在炎症应答中起重要作用。因此,本研究拟通过角膜血管生成（corneal neovascularization,CNV）模型,探讨TLR4及其内源性配体——高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box-1,HMGB1）在炎症导致的血管生成中的作用。实验首先通过分子克隆方法构建HMGB1全长、HMGB1 A box和B box的表达载体,提纯出具有生物活性的重组蛋白,并免疫新西兰兔制备抗HMGB1多克隆抗体,体内、外实验鉴定抗体的纯度、特异性、活性和效价。之后建立小鼠碱烧伤CNV模型,通过基因敲除和拮抗剂阻断等手段,应用实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）、组织病理学等检测方法,从分子、细胞和整体水平上探讨内源性HMGB1-TLR4信号通路在调节生物活性介质的表达、巨噬细胞的局部活化浸润等方面的作用。研究结果显示,TLR4基因的缺失可明显抑制碱烧伤CNV的形成,减少烧伤角膜局部巨噬细胞浸润和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等生长因子的生成;而TLR2基因的缺失对CNV形成无明显影响。研究还发现野生型（wild type,WT）CNV模型小鼠角膜局部HMGB1和TLR4表达上调。烧伤角膜局部外用HMGB1活性蛋白可加重WT小鼠CNV的形成及角膜局部巨噬细胞浸润,但却对TLR4-/-小鼠无明显效果;HMGB1刺激体外收集的WT小鼠腹腔巨噬细胞后,其VEGF等生长因子表达上调的幅度显著高于TLR4-/-腹腔巨噬细胞,印证了体内CNV模型HMGB1给药的观察结果。HMGB1和TLR4的特异性拮抗剂眼表给药抑制WT小鼠CNV的形成及角膜局部巨噬细胞浸润,从另一角度说明了内源性HMGB1-TLR4信号通路在CNV形成中的重要作用。总之,研究结果表明碱烧伤角膜局部内源性HMGB1-TLR4信号通路可增强巨噬细胞的活化浸润以及炎症介质、生长因子的分泌,从而介导CNV的形成。此发现为进一步阐明CNV的发生机理提供新的理论依据,同时也期望可为病理性新生血管相关疾病的防治提供新的思路和方法。