Bt抗虫水稻的培育

论文摘要

本研究以优良的水稻恢复系明恢63为受体材料，采用农杆菌介导的遗传转化方法，将人工合成的cry1C*基因和cry1Ab基因分别转入其中，获得了一批外源基因单拷贝插入、抗虫性优良及农艺性状良好的转基因株系。在试验过程中，阳性转基因植物在T0代通过PCR初步证实，其拷贝数经Southern杂交确定。转基因纯合单株的筛选经过发芽试验获得，Bt蛋白含量采用ELISA法进行测定。通过室内及田间接虫试验获得了杀虫蛋白表达量高、抗虫性优良、农艺性状良好、具有商品化价值的转cry1C*基因株系5个和转cry1Ab基因株系4个。 2005年，转cry1C*基因株系T1C-19和转cry1Ab基因株系T1Ab-6已通过转基因生物安全性评价的中间试验。目前，纯合转基因株系及初步获得的转双价Bt植株正在继续试验，进一步考察其大田的抗虫性和遗传稳定性并希望2006年通过在湖北省的环境释放。 本研究获得的主要结果如下： 1．构建了cry1C*基因的转化载体pBar-1C*和cry1Ab基因的转化载体pBar-1Ab，并分别转化明恢63胚性愈伤，共获得cry1C*基因的独立转化子120株，cry1Ab基因的独立转化子92株。 2．Southern blotting杂交结果表明，120个转cry1C*基因植株中，19个为单拷贝；92个转cry1Ab基因植株中，13个为单拷贝。通过发芽试验，获得11个含cry1C*基因的单拷贝纯合系，9个含cry1Ab基因的单拷贝纯合系。 3．根据高抗虫性、农艺性状没有明显的改变、外源基因单拷贝插入、后代分离符合孟德尔遗传规律等四个筛选标准，从11个单拷贝的转cry1C*基因植株中，获得了5个候选株系；从9个单拷贝的转cry1Ab基因植株中获得4个候选株系。 4．室内人工接种试验的结果显示，所筛选的转基因株系对水稻的两种主要钻蛀性害虫二化螟（Chilo suppressalis walker）和三化螟（Tryporyza incertulas walker）表现高度抗性：在接种一龄二化螟或三化螟幼虫后，其5天内的幼虫死亡率为100％或接近100％。 5．蛋白含量的ELISA测定结果表明：不同转基因株系的Bt蛋白表达量不同，转cry1C*基因株系的蛋白表达量最高为1.42ng／mg鲜叶重，转cry1Ab基因株系的蛋白表达量最高为3.66ng／mg鲜叶重。同一株系，分蘖初期与拔节期的蛋白含量没有太大的

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 1 文献综述
• 1.1 BT杀虫晶体蛋白及其基因
• 1.1.1 Bt的生物学特性
• 1.1.2 Bt杀虫蛋白的结构与功能
• 1.1.3 Bt晶体蛋白的杀虫机制
• 1.1.4 Bt杀虫晶体蛋白及其基因的分类
• 1.1.5 昆虫对Bt毒蛋白产生抗性的机理
• 1.2 转BT基因作物的商品化现状
• 1.2.1 Bt杀虫蛋白的应用简史
• 1.2.2 Bt基因导入植物的方法
• 1.2.3 全球转基因作物商品化现状
• 1.2.4 转Bt基因作物的商品化现状
• 1.2.5 中国的转基因研究及商品化现状
• 1.2.6 昆虫对转Bt作物抗性的产生及其对策
• 1.2.7 转基因植物的安全性及其评价
• 1.3 转BT水稻研究进展及其存在问题
• 1.4 研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 受体植物材料
• 2.1.2 目的基因
• 2.1.3 农杆菌菌株
• 2.1.4 植物表达载体的构建
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 农杆菌介导的遗传转化
• 2.2.2 选择压的确定
• 2.2.3 转基因植株的PCR检测
• 2.2.4 转基因植株的Southern blotting检测
• 2.2.5 转基因植株的除草剂抗性检测
• 2.2.6 转基因后代的遗传分析
• 2.2.7 转基因纯合阳性和阴性株系的筛选
• 2.2.8 转基因植株的室内接虫鉴定
• 2.2.9 转基因植株Bt蛋白含量的测定
• 2.2.10 转基因纯合系螟虫为害的田间调查及农艺性状的考察
• 2.2.11 2004年田间转基因纯合株系的抗性及农艺性状的田间评价
• 2.2.12 杂种的抗虫性及农艺性状的田间考察
• 2.2.13 2005年转基因纯合株系抗虫性及主要农艺性状的进一步考察
• 3 结果与分析
• *基因的特征'>3.1 合成的cry1C^*基因的特征
• 3.2 选择压的确定
• 3.3 愈伤诱导及农杆菌介导的遗传转化
• 3.4 初级转化子的PCR检测。
• 3.5 转基因植株的Southern杂交分析
• 3.6 Bt基因在后代中的遗传
• 3.7 纯合转基因系的筛选
• 3.8 纯合转基因株系的蛋白含量测定
• 3.9 纯合转基因株系的室内抗虫性鉴定
• 3.10 转基因株系及其杂种的田间抗性试验
• 3.11 具有商品化潜力的转基因株系筛选及田间试验
• 4 讨论
• *基因的应用前景'>4.1 cry1C^*基因的应用前景
• 4.2 单拷贝转基因植株的筛选
• 4.3 优良转基因株系的早代选择
• 4.4 Ubi启动子作为Bt基因启动子的优缺点分析
• 4.5 以bar基因为筛选标记的遗传转化
• 4.6 转基因株系对稻纵卷叶螟抗性的评价
• 4.7 转基因育种过程中农艺性状的改变及其克服
• 4.8 双价Bt基因的聚合策略分析
• 参考文献
• 附录
• 附录1 进行农杆菌介导的遗传转化时所用培养基及操作过程
• 附录2 CTAB法提取植物基因组DNA
• 附录3 SOUTHERN杂交程序
• 附录4 个人简历
• 致谢