猪血凝性脑脊髓炎病毒R、S基因的RNAi研究

论文摘要

PHEV主要感染1-3周龄的仔猪,临床上以呕吐、衰竭和明显的神经症状为主要特征,对养猪业尤其是SPF猪的养殖存在很大的潜在风险。因此对于该病的防治及其治病机理的研究是很有意义的。PHE主要由冠状病毒PHEV感染引起。PHEV的S蛋白是一种多功能蛋白,存在于病毒的表面成花瓣状,在冠状病毒的生物学以及致病性机理上扮演着非常重要的角色。结构蛋白S具有激发机体产生免疫反应、中和病毒抗体和抑制HA活动等功能。而PHEV的非结构蛋白R具有种属特异性,可以利用该基因的不同区分冠状病毒,在病毒的复制和基因组RNA的翻译过程中起着非常重要的作用。另外,RNAi途径在调节病毒和细胞的相互关系上显得非常重要;RNAi为抗病毒研究提供了新的思路。鉴于此本研究首次针对PHEV的R和S基因利用RNAi原理设计合成了siRNA和shRNA,并研究了它们对PHEV在PK-15细胞上增殖的影响。首先,本实验应用CPE分析、IFA、HA、TCID50和Real time RT-PCR实验方法,分别从不同时间PHEV在PK-15细胞上增殖的基因表达产物、病毒感染滴度和病毒基因组RNA复制水平三个方面进行了研究。IFA检测结果显示:感染后12h能检测到被荧光抗体染色的细胞,随感染时间的延长,出现荧光的细胞数量逐渐增多,在感染32h后,所有细胞均能发出荧光。Real time RT-PCR结果显示:病毒感染细胞32-48h后其基因组RNA的分子数快速增加,病毒的基因组RNA复制呈加速趋势,基因组RNA的数量在感染后48h达到一个高峰,之后增殖速度减缓,并在56h细胞出现CPE。病毒的感染滴度（TCID50）增加趋势与基因组类似。其次,在以上实验的基础上针对该病毒的R和S基因设计合成4对siRNA,转染细胞以后接种PHEV。然后通过CPE分析、IFA、HA、TCID50和Real time RT-PCR检测在PK-15细胞siRNA抑制PHEV增殖效果。CPE分析结果表明siRNA能有效的抑制病毒致细胞出现病变的作用。另外感染后48h IFA检测结果表明siRNA能明显的抑制病毒在PK-15细胞上的抗原蛋白的表达。HA和TCID50检测结果表明:siRNA转染组抑制效率分别为阴性对照组的18-32倍和93-494倍。而Real timeRT-PCR结果表明siRNA的抑制效率达到53%-91%。最后,以上结果表明siRNA能有效的抑制病毒的增殖,但是siRNA的作用具有时效性。围绕这个问题,构建了shR2和shS2真核表达载体,转染PK-15细胞然后接种PHEV。通过CPE分析、IFA、HA、TCID50和Real time RT-PCR检测shRNA的抑制效果,结果表明shR2和shS2都能明显的抑制病毒的增殖,尤其是shR2抑制效率高达89%。选择shR2真核表达载体通过G-418筛选出稳定的细胞系shR2-1和shR2-2。通过CPE分析结果表明筛选出的细胞系shR2-1和shR2-2都能明显的抑制病毒的增殖。而TCID50检测结果表明细胞系shR2-2在感染病毒72h后仍能对病毒产生66倍的抑制作用。细胞系shR2-2抑制PHEV增殖的作用能持续到120h。总之,本实验结果表明通过RNAi途径能很方便的研究PHEV基因功能和复制的关系,实验结果能为PHEV的防治提供新的思路以及为研究PHEV复制和感染机理提供参考依据。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 英文缩略词
• 第一篇 文献综述
• 第1章 RNA 沉默及其抗病毒作用
• 1.1 RNAi 的沉默机制
• 1.2.R NAi 的抗病毒效应
• 1.3 miRNA 的发现
• 1.4 RNAi 的抗病毒作用
• 1.5 RNAi 作用的提高与解除
• 1.6 RNAi 和转录沉默之间的关系
• 1.7 结论
• 第2章 冠状病毒及其防治
• 2.1 冠状病毒的分类
• 2.2 抑制冠状病毒入侵
• 2.3 冠状病毒的融合抑制
• 2.4 利用干扰素抑制冠状病毒的复制
• 2.5 RNAi 对冠状病毒增殖的抑制作用
• 2.6 靶向病毒蛋白酶抑制冠状病毒的复制
• 2.7 用其他复合物抑制冠状病毒的复制
• 2.8 小结
• 第二篇 研究内容
• 第1章 PHEV 在PK-15 细胞上增殖特性的研究
• 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第2章 siRNA 抑制 PHEV 的增殖效果研究
• 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第3章 shRNA 抑制 PHEV 增殖效果的研究
• 材料和方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士期间发表的学术论文
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介