酵母双杂交技术筛选与NS3TP2蛋白结合的肝细胞蛋白编码基因

论文摘要

一、背景和目的丙型肝炎病毒（HCV）属黄病毒科，可引起慢性肝炎、肝硬化及肝癌，目前世界上有1.7亿人感染，治疗上只有干扰素和利巴韦林，而且疗效有限。对于HCV分子生物学机制的阐明是进行抗病毒治疗和最终战胜丙型肝炎及相关疾病的重要前提。HCV基因组转录翻译为一条多肽前体，然后在信号肽酶和蛋白酶的作用下裂解为10个蛋白，包括Core、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B。其中编码631个氨基酸、大小约70KD的非结构蛋白NS3是一种多功能蛋白质，具有丝氨酸蛋白酶、三磷酸核苷酸酶（NTPase）和RNA解旋酶（helicase）的功能，在HCV复制及表达产物多聚蛋白的裂解加工上起重要作用。研究表明，HCV NS3蛋白还可能通过反式激活作用调控细胞内多种病毒及细胞基因的转录，在HCV致病（癌）过程中起着重要的作用。党晓燕等利用抑制性消减杂交技术（suppression substractive hybridization）、及生物信息学技术（bioinformatics）筛选并克隆了NS3蛋白反式激活的靶基因，发现它上调的基因中除了一些已知功能的基因外还包括一些未知功能的基因。其中之一命名为NS3TP2（HCV NS3-transactivated protein 2），利用生物信息学技术确定其ORF，并对其进行克隆化研究，顺利得到了NS3TP2的基因编码序列，在GenBank中注册，注册号为AY116970。为了进一步研究NS3TP2的生物学功能我们在酵母细胞中表达了该蛋白，并利用酵母双杂交技术在肝细胞cDNA文库中筛选与其作用的蛋白质基因，以期为HCV NS3蛋白在HCV致病机制中的作用的研究提供新的线索。二、研究方法：应用酵母双杂交系统3，将多聚酶链反应（PCR）法扩增的NS3TP2基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒，转化单倍体酵母细胞AH109并在其内表达，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析然后与转化了人肝细胞文库质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合，在涂有X-α-半乳糖（X-α-gal）的营养缺陷型培养基（SD／-Trp-Leu-His-Ade）上进行双重筛选生长，提取阳性酵母克隆的质粒，转化大肠杆菌提取质粒DNA，然后将此阳性文库质粒与诱饵质粒进行回交实验进一步筛选后测序，测序结果在GenBank中进行生物信息学分析。三、结果：成功构建NS3TP2蛋白基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示了NS3TP2蛋白在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在，分子量68 000 kd左右。经过回交实验后筛选出与NS3TP2结合的蛋白基因6种，其中包括空泡蛋白13同系物A（VSP13A）、脂酰辅酶A合成酶长链家族成员5（ACSL5）、线粒体基因、脂酰辅酶A结合蛋白（r-氨基丁酸受体调节因子，苯甲二氮卓结合抑制因子）、真核翻译延伸因子alpha 1、环指蛋白130。四、结论：1．成功构建了pGBKT7-NS3TP2酵母表达质粒。2．首次在酵母细胞中成功表达了pGBKT7-NS3TP2融合蛋白。3．利用酵母双杂交技术成功筛选出了在肝细胞中与HCVNS3TP2蛋白相互作用的蛋白质基因。一类是与蛋白质代谢相关的基因：空泡蛋白13同系物A、环指蛋白130、真核翻译延伸因子alpha 1。一类是与脂肪代谢相关的基因：脂酰辅酶A合成酶长链家族成员5（ACSL5）和脂酰辅酶A结合蛋白（ACBP）。4．NS3TP2作为HCV NS3反式激活的蛋白质在肝细胞的蛋白质代谢及脂肪代谢中扮演了一定的角色，尤其是在脂类代谢中，它可能介导了NS3对HCV感染的肝细胞脂类代谢的影响，在HCV感染患者脂肪肝的发生上起了一定的作用，为NS3TP2的生物学功能及HCV NS3致病机制的研究提供了新的线索。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文部分 酵母双杂交技术筛选与NS3TP2蛋白结合的肝细胞蛋白编码基因
• 前言
• 第一部分
• 第二部分
• 结论
• 参考文献
• 综述部分
• 综述 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3及其反式激活基因2的研究进展
• 参考文献
• 附录
• 缩略词表
• 致谢