本文主要研究内容
作者杨勇（2019）在《靶向OXA23基因的CRISPR-Cas9载体系统构建》一文中研究指出：目的:本研究以质粒pet41a为载体骨架,通过双酶切法从质粒pwt-Cas9、pgRNA中获得目的基因片段,构建CRISPR-Cas9载体系统,建立一种行之有效的基因编辑的载体,为研究细菌耐药基因提供方法;使用热转化和电转化两种常用分子技术手段,制备感受态细胞并优化转化条件,获得最大的转化效率。方法:1.收集宁夏医科大学总医院2016-2017年临床分离鉴定的鲍曼不动杆菌菌株105株。2.进行药敏及PCR技术筛选对卡那霉素敏感且含有OXA23基因的菌株。3.选择质粒pet41a、pgRNA和pwt-Cas9,分析质粒核酸序列及酶切位点。使用限制性核酸内切酶XhoI和BgiII分别酶切质粒pet41a和pwt-Cas9,获得具有相同粘性末端的线性质粒片段,回收并用T4DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-Cas9。使用BgiII和XbaI两种限制性内切酶分别酶切pet41-Cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-Cas9-sgRNA。分别将重组质粒pet41-Cas9和pet41a-Cas9-sgRNA转化BL-21(DE3),IPTG诱导后提取蛋白进行SDS-PAGE分析。4.选取鲍曼不动杆菌标准菌株ATCC17978,分别用去离子水和氯化钙制备鲍曼不动杆菌感受态细胞,并用制备的感受态细胞做电转化和热转化。结果:从临床上筛选得到2株对卡那霉素敏感且含有OXA23基因的菌株,分别命名为AB7、AB34。测序证实质粒pet41-Cas9、pet41a-Cas9-sgRNA连接正确,载体构建成功。重组质粒转化DE3后经IPTG诱导4 h,表达分子质量单位为160×10~3的重组蛋白,与Cas9蛋白理论分子质量相符。氯化钙法制备的感受态细胞在热转化条件下有阳性转化菌株生长,去离子水制备的感受态仅电转化下有阳性转化菌株生长。在不同电压转化时,1000v处开始才有阳性转化菌出现,电压越大,生长的菌落数越多。结论:1.成功构建CRISPR-Cas9载体系统质粒pet41a-Cas9-sgRNA并表达重组Cas9蛋白,为细菌基因的编辑研究奠定了前期基础。2.氯化钙法制备的感受态细胞热转化效率略高于去离子水法制备的感受态细胞;电转化效率明显高于热转化,转化效率随电压的增大而提高,在2000v处达到最大值。
Abstract
mu de :ben yan jiu yi zhi li pet41awei zai ti gu jia ,tong guo shuang mei qie fa cong zhi li pwt-Cas9、pgRNAzhong huo de mu de ji yin pian duan ,gou jian CRISPR-Cas9zai ti ji tong ,jian li yi chong hang zhi you xiao de ji yin bian ji de zai ti ,wei yan jiu xi jun nai yao ji yin di gong fang fa ;shi yong re zhuai hua he dian zhuai hua liang chong chang yong fen zi ji shu shou duan ,zhi bei gan shou tai xi bao bing you hua zhuai hua tiao jian ,huo de zui da de zhuai hua xiao lv 。fang fa :1.shou ji ning xia yi ke da xue zong yi yuan 2016-2017nian lin chuang fen li jian ding de bao man bu dong gan jun jun zhu 105zhu 。2.jin hang yao min ji PCRji shu shai shua dui ka na mei su min gan ju han you OXA23ji yin de jun zhu 。3.shua ze zhi li pet41a、pgRNAhe pwt-Cas9,fen xi zhi li he suan xu lie ji mei qie wei dian 。shi yong xian zhi xing he suan nei qie mei XhoIhe BgiIIfen bie mei qie zhi li pet41ahe pwt-Cas9,huo de ju you xiang tong nian xing mo duan de xian xing zhi li pian duan ,hui shou bing yong T4DNAlian jie mei lian jie ,lian jie chan wu zhuai hua DH5αgan shou tai xi bao ,zhuai hua jun tu bu han ka na mei su de gu ti LBpei yang ji ping ban jin hang yang xing chan ke long shai shua bing ce xu ,gou jian de zhi li ming ming wei pet41-Cas9。shi yong BgiIIhe XbaIliang chong xian zhi xing nei qie mei fen bie mei qie pet41-Cas9he pgRNA,jing hui shou chun hua 、lian jie he zhuai hua hou shai shua yang xing chan ke long jun la bing ce xu ,chong zu zhi li ming ming wei pet41a-Cas9-sgRNA。fen bie jiang chong zu zhi li pet41-Cas9he pet41a-Cas9-sgRNAzhuai hua BL-21(DE3),IPTGyou dao hou di qu dan bai jin hang SDS-PAGEfen xi 。4.shua qu bao man bu dong gan jun biao zhun jun zhu ATCC17978,fen bie yong qu li zi shui he lv hua gai zhi bei bao man bu dong gan jun gan shou tai xi bao ,bing yong zhi bei de gan shou tai xi bao zuo dian zhuai hua he re zhuai hua 。jie guo :cong lin chuang shang shai shua de dao 2zhu dui ka na mei su min gan ju han you OXA23ji yin de jun zhu ,fen bie ming ming wei AB7、AB34。ce xu zheng shi zhi li pet41-Cas9、pet41a-Cas9-sgRNAlian jie zheng que ,zai ti gou jian cheng gong 。chong zu zhi li zhuai hua DE3hou jing IPTGyou dao 4 h,biao da fen zi zhi liang chan wei wei 160×10~3de chong zu dan bai ,yu Cas9dan bai li lun fen zi zhi liang xiang fu 。lv hua gai fa zhi bei de gan shou tai xi bao zai re zhuai hua tiao jian xia you yang xing zhuai hua jun zhu sheng chang ,qu li zi shui zhi bei de gan shou tai jin dian zhuai hua xia you yang xing zhuai hua jun zhu sheng chang 。zai bu tong dian ya zhuai hua shi ,1000vchu kai shi cai you yang xing zhuai hua jun chu xian ,dian ya yue da ,sheng chang de jun la shu yue duo 。jie lun :1.cheng gong gou jian CRISPR-Cas9zai ti ji tong zhi li pet41a-Cas9-sgRNAbing biao da chong zu Cas9dan bai ,wei xi jun ji yin de bian ji yan jiu dian ding le qian ji ji chu 。2.lv hua gai fa zhi bei de gan shou tai xi bao re zhuai hua xiao lv lve gao yu qu li zi shui fa zhi bei de gan shou tai xi bao ;dian zhuai hua xiao lv ming xian gao yu re zhuai hua ,zhuai hua xiao lv sui dian ya de zeng da er di gao ,zai 2000vchu da dao zui da zhi 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自宁夏医科大学的杨勇，发表于刊物宁夏医科大学2019-07-22论文，是一篇关于基因论文,感受态细胞论文,转化论文,宁夏医科大学2019-07-22论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自宁夏医科大学2019-07-22论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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