论文摘要
从5个天然居群（江西三清山、安徽休宁、浙江临安、湖南阳明山自然保护区、阳明山老屋场）采集华东黄杉样本,以改良的CTAB法从华东黄杉叶片中制备模板DNA,优化了PCR循环参数,建立了ISSR-PCR扩增的最佳反应体系,筛选出扩增多态性片断较多且扩增产物稳定的引物,通过10条ISSR引物对89个华东黄杉个体的基因组DNA进行扩增,对华东黄杉居群的遗传多样性和遗传结构进行了研究。研究结果表明:CTAB提取液中的体积和提取时间对模板DNA有一定的影响。ISSR扩增条件为:20μLPCR反应体系中,2μL１0χTaq酶配套缓冲液,1.5U Taq聚合酶,1.5～2.5mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.2mmol/L dNTPs,10ng/L模板DNA。最佳扩增反应程序:94℃变性5min,1个循环;94℃变性30s,52℃（46-56℃不定）退火45s,72℃延伸2min,40个循环;最后在72℃延伸5min,1个循环。共对100条ISSR引物进行了筛选,分别筛选出扩增条带较多、信号强、背景清晰的10条ISSR引物用于5个居群DNA样本扩增,共扩增出76条带,其中多态性条带数为69个,多态性位点百分比为90.79%,以三清山居群的多态性位点百分比89.47%,安徽休宁居群的多态性百分比最低为56.58%。根据不同个体的扩增图构建了0、1矩阵（其中模糊带和弱带忽略不计）输入计算机。对ISSR数据处理结果如下:POPGENE分析结果表明,华东黄杉具有丰富的遗传多样性,Nei’s基因多样性H=0.3361,Shannon’s多态性指数I=0.4974。AMOVA分析表明,在总的遗传变异中有26.88%的变异发生在居群间,73.12%的变异发生在居群内。由UPGMA聚类分析得知,5个居群中,湖南阳明山两支与浙江先聚为一支,再与安徽休宁聚为一支,最后与江西三清山聚合。鉴于华东黄杉生境环境的特殊性和人为大量的砍伐,华东黄杉的数量逐渐减少,建议在华东黄杉分布区建立自然保护区,以江西三清山为核心地区,对其生存空间进行长期、有效的保护。另外,在居群间进行植株和幼苗的相互移栽,以提高居群间的基因交流,最大限度保护华东黄杉的遗传多样性。