水解人参皂苷Rb1的微生物筛选

论文摘要

本论文采用中国吉林省长白山人参种植地的土壤,从中筛选出产人参皂苷Rb1水解酶的的微生物,并对微生物的发酵条件、酶的分离纯化、提纯酶的酶性质和特异性进行了研究。经过筛选,得到能产人参皂苷Rb1水解酶的的微生物,其发酵条件为,发酵培养基:胰蛋白胨10g,酵母膏5g,氯化钠10g,水1L;最佳诱导物为人参总皂苷;诱导物加入量为3.2mg人参总皂苷/mL培养基;最佳培养温度为28℃;接菌量为250μL菌液/20mL培养基。对发酵曲线的研究表明,产酶的发酵时间应控制在对数生长期的后期,即20～25h。人参皂苷Rb1水解酶经DEAE-Cellulose DE52柱进行分离纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测显示为单一条带,确定其酶蛋白分子量约为47KDa。将提纯后的人参皂苷Rb1水解酶进行酶性质研究,得到最适pH值是4.0,并在pH2.2～pH10范围内稳定;最适反应温度是25℃,并在20℃～60℃范围内稳定。Fe3+离子对酶反应激活作用显著,Cu2+离子对酶反应有抑制作用,而K+、Na+、Mg2+、Zn2+和Ca2+离子都对酶反应无作用。酶反应动力学方程为V=0.0423[S]/（1.045+[S]）,最大反应速率 Vmax=0.0423mmol/L·h,米氏常数 Km=1.045mmol/L。对提纯酶进行底物特异性研究,结果表明此酶对人参二醇类皂苷和淫羊藿苷有水解作用,并能分步水解人参二醇类皂苷C20位上的葡萄糖苷键,水解人参皂苷Rb1经过人参皂苷Rd最终生成人参皂苷Rg3。同时此酶不具有α-淀粉酶的水解能力,只对pNP-β-D-Gal的半乳糖苷键有很弱的水解能力,而对pNP-α-D-Gal、pNP-β-D-Glc、pNP-α-D-Glc和pNPR中的糖苷键均无水解能力,说明此酶为一特异性酶。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 人参
• 1.1.1 人参的形态
• 1.1.2 人参的生长分布
• 1.1.3 人参的生物学作用
• 1.1.3.1 对中枢神经系统的特异作用
• 1.1.3.2 抗炎防癌
• 1.1.3.3 对糖尿病的作用
• 1.1.4 人参的成分
• 1.2 人参皂苷
• 1.2.1 人参皂苷的分类
• 1.2.2 人参皂苷的结构
• 1.2.3 人参皂苷的生物学作用
• 1.2.3.1 人参皂苷的延缓衰老作用
• 1.2.3.2 人参皂苷对缺血状态的缓解作用
• 1.2.3.3 促进造血细胞发生
• 1.3 人参皂苷Rb
• 1的结构'>1.3.1 人参皂苷Rb₁的结构
• 1的生物学作用'>1.3.2 人参皂苷Rb₁的生物学作用
• 1对免疫系统的作用'>1.3.2.1 人参皂苷Rb₁对免疫系统的作用
• 1对呼吸系统的保护作用'>1.3.2.2 人参皂苷Rb₁对呼吸系统的保护作用
• 1对内皮细胞的保护作用'>1.3.2.3 人参皂苷Rb₁对内皮细胞的保护作用
• 1的性质'>1.3.3 人参皂苷Rb₁的性质
• 3'>1.4 人参皂苷Rg₃
• 3的性质与结构'>1.4.1 人参皂苷Rg₃的性质与结构
• 3的生物学作用'>1.4.2 人参皂苷Rg₃的生物学作用
• 3抗肿瘤生长及抑制转移的作用'>1.4.2.1 人参皂苷Rg₃抗肿瘤生长及抑制转移的作用
• 3对免疫功能的影响'>1.4.2.2 人参皂苷Rg₃对免疫功能的影响
• 1.4.2.3 抗病毒作用
• 1的研究进展'>1.5 酶法水解人参皂苷Rb₁的研究进展
• 1.6 前景展望
• 1.7 论文的主要研究内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 菌种来源
• 2.2 实验试剂
• 2.3 实验仪器
• 2.4 培养基
• 2.5 试剂制备
• 1底物溶液的制备'>2.5.1 人参皂苷Rb₁底物溶液的制备
• 2.5.2 人参皂苷标准品溶液的制备
• 2.5.3 人参总皂苷和芦丁营养液的制备
• 2.5.4 豆粕、穿山龙、槐花和人参浸出液的制备
• 2.6 实验方法
• 1菌种的筛选'>2.6.1 水解人参皂苷Rb₁菌种的筛选
• 2.6.1.1 样品的采集以及预处理
• 2.6.1.2 菌种的富集培养
• 2.6.1.3 菌种分离
• 2.6.1.4 菌种的初筛
• 2.6.1.5 菌种的复筛
• 2.6.1.6 酶液的提取
• 2.6.1.7 酶与底物的反应
• 2.6.1.8 TLC点板（薄层层析）
• 2.6.2 菌种发酵条件的优化
• 2.6.2.1 培养基的确定
• 2.6.2.2 诱导物的确定
• 2.6.2.3 诱导物加入量的确定
• 2.6.2.4 培养温度的确定
• 2.6.2.5 接菌量的确定
• 2.6.3 发酵曲线的制定
• 2.6.3.1 发酵液pH值的测定
• 2.6.3.2 酶活力的测定
• 2.6.3.3 菌体浓度的测定
• 2.6.3.4 蛋白质浓度的测定
• 2.6.4 酶的分离纯化-离子交换层析
• 2.6.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳纯度检测
• 2.6.6 提纯酶的酶性质研究
• 2.6.6.1 最适pH值的研究
• 2.6.6.2 pH稳定性的研究
• 2.6.6.3 最适反应温度的研究
• 2.6.6.4 温度稳定性的研究
• 2.6.6.5 米氏常数的研究
• 2.6.6.6 金属离子对酶活力的影响
• 1水解酶的酶反应特性'>2.6.6.7 人参皂苷Rb₁水解酶的酶反应特性
• 2.6.6.8 提纯酶的其它酶活力测定
• 第三章 结果与讨论
• 1水解酶菌株的筛选'>3.1 产人参皂苷Rb₁水解酶菌株的筛选
• 3.2 菌体发酵条件的优化
• 1的最佳培养基'>3.2.1 水解人参皂苷Rb₁的最佳培养基
• 1的最佳诱导物'>3.2.2 水解人参皂苷Rb₁的最佳诱导物
• 3.2.3 诱导物的最适加入量
• 3.2.4 最适培养温度
• 3.2.5 最佳接菌量
• 3.3 发酵曲线
• 3.4 DEAE-Cellulose DE52柱分离纯化粗酶液
• 3.4.1 粗酶液的分离纯化
• 3.4.2 提纯酶的酶活力的检测
• 3.4.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测提纯酶的纯度
• 3.4.4 提纯酶分子量的测定
• 3.5 提纯酶的酶性质研究
• 3.5.1 酶反应的最适pH
• 3.5.2 pH稳定性的研究
• 3.5.3 酶反应的最适温度
• 3.5.4 温度稳定性的研究
• 3.5.5 金属离子对酶活力的影响
• 3.5.6 米氏常数的测定
• 3.5.7 酶反应底物特异性的研究
• 3.5.8 pNP系列酶活力的研究
• 3.5.9 α-淀粉酶活力的研究
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢