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酵母双杂交技术筛选与SOX4相互作用的蛋白质及其功能研究

2020-11-22阅读(740)

酵母双杂交技术筛选与SOX4相互作用的蛋白质及其功能研究

论文摘要

SOX4是SOX[SRY（Sex-related region Y）-box]转录因子家族重要成员,在胚胎发育过程中起关键的调控作用。SOX4选择性表达于动物卵巢,睾丸,胸腺以及T,前B淋巴细胞中。近年来越来越多的研究表明,SOX4在许多肿瘤组织中高表达,包括乳腺癌、结肠癌、肺癌、成髓细胞瘤以及肝癌等,提示SOX4可能与肿瘤形成有关。另有研究显示,SOX4在前列腺素诱导的肝细胞凋亡中表达增加,提示它可能参与了凋亡调控。SOX4参与了许多生理及病理过程的调控,但它发挥作用的机制尚不清楚。为了进一步揭示SOX4重要的生物学功能,特别是它在细胞凋亡中发挥的重要作用,我们应用酵母双杂交筛选技术对SOX4相互作用蛋白质进行了筛选并对其功能进行了初步研究。 我们分别以人SOX4的两个片断SOX4（aa1-133）和SOX4（aa130-380）分别作为诱饵,从人乳腺文库中筛选与其相互作用的蛋白质。通过四缺培养板的初步筛选,我们从总共4.11x106个文库质粒中得到184个候选克隆可能与SOX4存在相互作用,随后经过蓝白斑继续筛选,剩下138个候选克隆。提取138个文库质粒后再分别与诱饵质粒共转酵母细胞后再通过四缺培养板和蓝白斑筛选,最终我们得到4个阳性克隆。测序结果表明,这4个克隆为同一基因来源:Ubc9（Ubiquitin-conjugating enzyme 9）。Ubc9蛋白全长158个氨基酸,从酵母到人进化高度保守,是泛素连接E2酶（Ubiquitin-Conjugating Enzyme）家族重要成员。我们从人乳腺文库中钓取了其cDNA序列,为下一步的结构和功能研究做好准备。SOX4与Ubc9之间的相互作用随后通过体

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 引言
  • 第一部分 酵母双杂交技术筛选与SOX4相互作用的蛋白质
  • 材料与方法
  • 1.材料及来源
  • 1.1 菌株和质粒
  • 1.2 主要试剂
  • 2.实验方法
  • 2.1 pGBKT7-SOX4（1-133）和pGBKT7-SOX4（130-380）载体构建
  • 2.2 Ubc9基因的钓取和克隆
  • 2.3 文库扩增
  • 2.4 酵母细胞的转化
  • 2.5 质粒提取、酶切片段纯化、PCR反应产物回收
  • 2.6 Western blot分析
  • 2.7 从酵母中提取质粒
  • 结果
  • 1.诱饵表达载体的构建和鉴定
  • 2.诱饵蛋白在酵母细胞中的表达鉴定
  • 3.诱饵蛋白在酵母细胞中自身转录激活活性的测定
  • 4.人乳腺文库的扩增
  • 5.初步筛选结果
  • 6.重复鉴定结果
  • 7.筛选到的基因cDNA序列的钓取及克隆
  • 小结
  • 第二部分 SOX4与Ubc9相互作用的验证
  • 材料与方法
  • 1.材料、试剂及仪器
  • 1.1 质粒、菌株、细胞株
  • 1.2 主要试剂
  • 1.3 细胞培养试剂
  • 2.实验方法
  • 2.1 酵母表达载体的构建
  • 2.2 GST融合表达载体的构建
  • 2.3 GFP-SOX4和RFP-Ubc9融合表达载体的构建
  • 2.4 293T细胞瞬时转染
  • 2.5 GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达
  • 2.6 GST沉淀（GST pull-down）分析
  • 2.7 免疫共沉淀
  • 结果
  • 1.酵母表达载体的构建及鉴定
  • 2.GST表达载体的构建，鉴定以及诱导表达与纯化
  • 2.1 GST表达载体的构建与鉴定
  • 2.2 GST-Ubc9融合蛋白的诱导表达与纯化
  • 3.GFP-SOX4和RFP-Ubc9表达载体的构建
  • 4.SOX4与Ubc9相互作用的验证
  • 4.1 SOX4及缺失突变体在酵母里与Ubc9的结合
  • 4.2 SOX4与Ubc9在体外的相互作用
  • 4.3 SOX4与Ubc9在体内的相互作用
  • 4.4 SOX4与Ubc9在活细胞内的共定位
  • 小结
  • 第三部分 SOX4与Ubc9复合物的初步功能研究
  • 材料与方法
  • 1 材料
  • 1.1 细胞株、质粒
  • 1.2 试剂及仪器
  • 2.实验方法
  • 2.1 SOX11表达载体的构建
  • 2.2 Ubc9C93S突变体表达载体的构建
  • 2.3 细胞转染
  • 2.4 荧光素酶活性测定方法
  • 结果
  • 1.pDBD-SOX11载体的构建
  • 2.pXJ40-HA-Ubc9C93S表达载体的构建
  • 3.Ubc9对SOX4转录活性的影响
  • 3.1 Ubc9抑制SOX4的转录活性
  • 3.2 Ubc9对SOX11的转录活性无影响
  • 3.3 Ubc9抑制SOX4的转录活性与其SUMO-1连接酶活性无关
  • 3.4 Ubc9在T47D细胞中抑制内源性的SON4的转录活性
  • 4.SOX4和Ubc9对p53转录活性的影响
  • 5.SOX4-Ubc9复合物对p53转录活性的影响
  • 小结
  • 讨论
  • 总结
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录
  • 英文缩略词
  • 发表的文章

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