微生物转化法生产7-ADAC

论文摘要

20世纪90年代以来,抗生素的研究开发仍然以β-内酰胺类为主,尤其以半合成头孢菌素居多。头孢菌素的母核按其结构可分为7-ACA和7-ADCA两大类。在对头孢菌素的半合成研究中,由3-位去乙酰基的头孢中间体衍生得到的头孢类抗生素在临床应用中有其突出的优点,引起了化学家和生物学家对其的重视。将7-ACA转化为7-ADAC,获得的产物7-ADAC的3-位上有活性羟基,可以为后续的各种改造提供有利条件。 目前,7-ADAC是由7-ACA经化学或者酶法脱乙酰基而来的。化学法反应慢,而且容易形成内酯,为后续反应带来困难,因此,酶法生产7-ADAC的研究成为必要。本文研究了枯草杆菌和粘红酵母头孢菌素C乙酰水解酶的活性,对活性较好的粘红酵母进行了菌种选育及发酵条件的优化,获得了活性明显提高的菌株。同时,对反应条件进行了优化,使得反应在lh内完成,摩尔转化率大于99%。利用等电点沉淀的方法分离得到产物,纯度达98%以上。反应和纯化的摩尔总收率可达88%。 在以上研究基础上,本文还用PCR方法从枯草杆菌6633基因组DNA中扩增得到了头孢菌素C乙酰水解酶（CAH）的基因,并测定其核苷酸序列。利用基因重组技术构建了该基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,经SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳验证,表达蛋白占蛋白总量的21.3%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写
• 第一章 文献综述
• 1.1 β-内酰胺类药物的发展现状
• 1.1.1 青霉素类抗生素
• 1.1.2 头孢菌素类抗生素
• 1.1.3 其他β-内酰胺类抗生素
• 1.1.3.1 碳青霉烯类
• 1.1.3.2 青霉烯类
• 1.1.3.3 新型头孢类
• 1.2 头孢菌素类抗生素半合成现状
• 1.2.1 头孢菌素及其衍生物的合成
• 1.2.2 国内外研究现状
• 1.2.3 中间体7-ADAC的生产
• 1.2.4 CAH的研究进展
• 1.3 前景
• 1.4 本课题的意义和目的
• 参考文献
• 第二章 转化菌种的选育、条件优化、产物纯化及结构确证
• 2.1 仪器和材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 主要仪器和设备
• 2.1.3 主要试剂及溶液
• 2.1.4 培养基与培养条件
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 枯草杆菌6633和枯草杆菌63051的转化活性测定
• 2.2.2 粘红酵母SIPI-04701的转化活性测定
• 2.2.3 粘红酵母的紫外诱变筛选
• 2.2.4 培养参数的优化
• 2.2.4.1 培养时间的确定
• 2.2.4.2 培养温度的选择
• 2.2.4.3 摇瓶装量实验
• 2.2.5 培养基的优化
• 2.2.5.1 碳源试验
• 2.2.5.2 氮源试验
• 2.2.5.3 正交试验
• 2.2.6 转化条件实验
• 2.2.6.1 转化温度实验
• 2.2.6.2 反应最佳pH的确定
• 2.2.6.3 底物浓度实验
• 2.2.7 产物的分离纯化
• 2.2.8 产物的结构鉴定
• 2.2.8.1 TLC鉴定
• 2.2.8.2 HPLC鉴定
• 1H-NMR及¹³C-NMR鉴定'>2.2.8.3 MS、¹H-NMR及¹³C-NMR鉴定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 枯草杆菌6633及63051对7-ACA的转化情况
• 2.3.2 粘红酵母SIPI-04701的转化活性测定
• 2.3.3 粘红酵母SIPI-04701的紫外诱变
• 2.3.4 高转化活性菌株的遗传稳定性
• 2.3.5 培养参数的优化
• 2.3.5.1 菌体培养时间的确定
• 2.3.5.2 培养温度的选择
• 2.3.5.3 摇瓶装量实验
• 2.3.6 培养基的优化
• 2.3.6.1 碳源试验
• 2.3.6.2 氮源实验
• 2.3.6.3 正交实验结果
• 2.3.7 转化条件实验结果
• 2.3.7.1 温度实验
• 2.3.7.2 最佳pH实验
• 2.3.7.3 底物浓度实验
• 2.3.7.4 小结
• 2.3.8 产物的分离纯化
• 2.3.9 产物的结构鉴定
• 2.3.9.1 TLC鉴定
• 2.3.9.2 HPLC鉴定
• 1H-NMR及¹³C-NMR谱数据'>2.3.9.3 MS、¹H-NMR及¹³C-NMR谱数据
• 2.4 讨论
• 第三章 头孢菌素C乙酰水解酶的克隆与表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要溶液和缓冲液
• 3.1.4 试剂
• 3.1.5 主要仪器和设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 菌种的培养和保藏
• 3.2.2 枯草杆菌基因组的提取
• 3.2.3 PCR反应
• 3.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2法将质粒转化大肠杆菌'>3.2.5 CaCl₂法将质粒转化大肠杆菌
• 3.2.6 大肠杆菌质粒的分离
• 3.2.7 DNA片断的回收
• 3.2.8 DNA序列的测定
• 3.2.9 pLY-5BL／E. coli DH5α的构建及蛋白表达
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 枯草杆菌ATCC 6633的基因组提取
• 3.3.2 PCR扩增枯草杆菌中的cah基因
• 3.3.3 cab基因的亚克隆和测序
• 3.3.4 cah基因的表达
• 3.4 讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 硕士研究生期间发表的论文