马尔尼菲青霉特异性基因的克隆表达及多克隆抗体的制备

论文摘要

背景和目的:马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei, P.m）是一种双相致病真菌,由其所致的马尔尼菲青霉病（Penicilliosis marneffei）主要流行于东南亚和我国的南方地区,主要见于免疫缺陷患者,现已成为该地区人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染者的一种重要的继发性感染。P.m 侵犯人体的单核巨噬系统,没有特异的临床表现,过去的确诊常依赖于真菌培养,但常使时间延误。病理诊断有时易和其它巨噬细胞内病原体混淆。香港大学发现了编码P.m 细胞壁甘露糖蛋白的MP1 基因,并开发出的免疫学诊断试剂,取得较好的使用效果,但有时仍和曲霉（Aspergillus）出现交叉反应造成误诊。因此,通过构建P.m 的cDNA 文库,寻找新的编码P.m特异性抗原蛋白的基因,制备特异性抗体用于马尔尼菲青霉病的诊断以提高诊断效率是很有必要的。方法:（1）构建P.m 28℃和37℃双相的cDNA 文库并对文库进行基因测序,通过生物信息学方法对基因序列进行分析,以发现有价值的基因。（2）用生物信息学方法对新发现的P.m 的PYA02460（简称60）和PYA01292（简称92）两条全长基因进行功能和定位的预测。（3）用原核表达的方法,将这两条基因的部分序列插入表达质粒pGEX-5X-1,用大肠杆菌表达成融合谷胱甘肽-硫-转移酶（glutathione S-transferase,GST）标签的蛋白质（GST-60p, GST-92p）,经Glutathione Sepharose 4B 亲合层析提纯后以此蛋白质为抗原对新西兰兔进行皮下免疫注射制备兔抗血清,再用免疫亲合层析法用这两种蛋白质从血清中提纯特异性的多克隆抗体。（4）用纯化的抗体做Western 免疫印迹,验证60p 和92p 在P.m 细胞壁上的特异性。（5）用伴刀豆蛋白A（Concanavalin A,ConA）初步验证60p 和92p 是否为糖蛋白。（6）将这两个抗体用于P.m 及各种真菌病的病理组织的免疫组化诊断,初步验证其特异性和灵敏性。

论文目录

• 英汉缩略对照表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 2 实验材料
• 3 实验方法
• 3.1 前期工作:P.m cDNA文库的构建（简述）
• 3.2 对60 和92 两条基因序列进行生物信息学分析
• 3.3 60和92两条基因的表达质粒的构建
• 3.4 60p 和92p 蛋白的表达和纯化
• 3.5 兔抗血清的制备和抗体的纯化
• 3.6 Western 免疫印迹法检测抗体对 P.m 细胞壁上目的蛋白的特异性
• 3.7 ConA 试验检测细胞壁上的目的蛋白是否为糖蛋白
• 3.8 免疫组织化学染色检测抗体的灵敏性和特异性
• 4 结果
• 4.1 cDNA 文库和60、92 两条基因序列
• 4.2 对60 和92 两条基因序列进行生物信息学分析的结果
• 4.3 60 和92 基因的表达质粒的构建结果
• 4.4 60p 和92p 蛋白的表达和纯化结果
• 4.5 兔抗血清的制备和多克隆抗体的纯化结果
• 4.6 抗体和 P.m 细胞壁提取物做 Western 免疫印迹结果
• 4.7 ConA 试验结果
• 4.8 免疫组织化学染色结果
• 5 讨论
• 6 结论
• 综述
• 致谢