耐高温酵母的筛选及糖蜜乙醇发酵研究

论文摘要

在全球环境日益恶化和能源危机日益严重的今天,乙醇作为一种绿色的可再生的清洁能源,正逐渐成为各国能源发展的方向。乙醇生产的途径目前主要是以微生物发酵为主,工业上,采用的酵母一般是在30-33℃下发酵,但是由于季节环境以及酵母发酵自身产热等因素影响,在发酵后期温度可高达38℃,为保证酵母的正常生长,必须采用降温手段,需要消耗大量能源,增加了乙醇生产的经济成本。因此,选育耐高温高产乙醇的酵母运用到工业生产上是具有重要意义的。本研究从西双版纳热带植物园土壤样品中筛选到20株酵母菌,以高温耐受与乙醇产量为指标,最终获得一株能耐受48℃高温且在48℃下正常发酵的乙醇高产菌株,编号为S16。对S16菌株进行形态学和生理生化鉴定试验结果为：S16以单端出芽方式进行无性繁殖,且产生卵圆形子囊孢子；可同化碳源包括棉子糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、乳糖、D-木糖、D-甘露醇、D-山梨醇、DL-乳酸、甘油、乙醇和柠檬酸盐,不能同化L-鼠李糖、L-山梨糖、可溶性淀粉、木糖醇、纤维二糖以及赤藓糖醇；不能同化氮源硝酸盐,可以同化乙胺；可在无维生素培养基上生长；在60%葡萄糖YPD培养基上生长：无脲酶活性;能在0.1%和0.01%放线菌酮中生长。参照1991年JA Barnett《酵母菌的特征与鉴定手册》,鉴定S16菌株属于克鲁维酵母属（Kluyveromyces）的马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。对S16进行分子水平鉴定试验,利用D1/D2+ITS区对S16进行分子鉴定,结果表明该区域扩增序列与GenkBank上报道的Kluyveromyces marxianusCHY1612具有99%的相似性。在分子水平上进一步确定了S16菌株为克鲁维酵母属（Kluyveromyces）的马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）。对S16菌株进行基本的生理特性研究,确定了酵母菌株的适宜生长温度范围为25℃～42℃,在液体和固体培养基上耐受最高温度均达到48℃,最适pH范围为3～7,42℃下耐乙醇浓度为6%,耐盐浓度为6%。对S16菌株发酵葡萄糖和蔗糖产乙醇的特性进行了初步研究,优化了发酵条件,结果显示,以葡萄糖为底物发酵时,在30℃-48℃范围内,乙醇最高浓度不受温度影响,但是乙醇生产速率变化明显,30℃时乙醇生产速率为2.85g/l/h,42℃时达到最高为3.792g/l/h,48℃时又降为1.826g/l/h；10h时,乙醇转化率在42℃时也达到最高为80.96%,此时发酵液中乙醇体积分数达到4.8%；以蔗糖为底物发酵时,12h时,42℃下乙醇生产速率最高,为3.389g.l/h,此时乙醇转化率为79.6%,最高乙醇转化率为91.3%,发酵液中乙醇体积分数达到6.2%。确定乙醇发酵葡萄糖和蔗糖的最适温度为42℃。对S16菌株利用甘蔗糖蜜发酵产乙醇的特性以及发酵条件进行了优化。通过单因素实验初步确定了S16菌株发酵糖蜜乙醇的最适锤度为20BX°,硫酸镁加入量为0.02%,酵母膏的添加量为0.5%。通过正交实验设计,以最终发酵液中乙醇含量为指标,最终确定S16菌株发酵甘蔗糖蜜乙醇的最适发酵初始锤度为20BX°,营养物质添加量分别为酵母膏0.5%,硫酸镁为0.04%。在优化的发酵条件下,进行糖蜜乙醇的摇瓶发酵试验,与工业耐高温菌株安琪酵母相比,12h内S16菌株的乙醇发酵速率要明显优于安琪酵母,12h时,S16菌株的发酵速率为3.3g/l/h,安琪酵母的乙醇发酵速率为2.66g/l/h,最终乙醇转化率也高于安琪酵母,达到理论产值的92.27%。糖蜜乙醇发酵废液是亟需解决的环境污染问题,本文对发酵后糖蜜乙醇废液的回用技术进行了初步研究,把发酵废醪液回收利用到糖蜜稀释工艺中,以代替清水,节约资源。在稀释糖蜜用液中加入不同比例的糖蜜乙醇发酵废液,结果发现添加不同比例的乙醇废液对S16菌株生长有一定程度的影响,但是添加75%以内的乙醇废液时,菌株生长和乙醇产量几乎不受任何影响,最终确定可以添加75%的乙醇废液作为回用,以达到乙醇生产工艺中的清洁指标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 图表目录
• 第1章 前言
• 1.1 燃料乙醇概述
• 1.2 国内外燃料乙醇产业发展现状
• 1.2.1 国外燃料乙醇产业发展现状
• 1.2.2 我国燃料乙醇发展现状
• 1.3 乙醇发酵原料与糖蜜发酵研究现状
• 1.3.1 粮食类作物生产乙醇
• 1.3.2 经济类作物生产乙醇
• 1.3.3 纤维素类物质生产乙醇
• 1.3.4 燃料乙醇发酵原料扩展
• 1.4 以糖蜜为原料生产乙醇的原理、现状以及存在的问题
• 1.4.1 糖蜜乙醇生产原理
• 1.4.2 糖蜜乙醇的生产现状
• 1.4.3 糖蜜乙醇发酵存在的问题
• 1.5 乙醇发酵菌株开发
• 1.5.1 耐高浓度底物及乙醇的酵母菌株开发
• 1.5.2 直接发酵生淀粉的菌株的开发
• 1.5.3 耐高温酵母菌株的开发
• 1.5.4 耐高温酵母在糖蜜乙醇发酵中的利用
• 1.6 糖蜜乙醇废液的危害
• 1.6.1 浓缩法
• 1.6.2 生化处理方法
• 1.6.3 物理化学方法处理
• 1.6.4 乙醇废液回收利用方案
• 1.7 课题选题意义及研究内容
• 1.7.1 选题意义
• 1.7.2 研究内容
• 第2章 耐高温酵母的筛选与鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 酵母菌分离源
• 2.2.2 供试菌种
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 主要试剂和溶液
• 2.2.5 主要仪器设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 酵母菌的富集与分离
• 2.3.2 酵母菌的筛选
• 2.3.3 酵母菌鉴定
• 2.3.4 S16菌株生理特性研究
• 2.3.5 分析方法
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 酵母菌的筛选结果
• 2.4.2 酵母菌的鉴定
• 2.4.3 分离菌株S16的基本生理特性研究
• 2.5 本章小结
• 第3章 S16菌株利用葡萄糖和蔗糖的发酵特性研究及其乙醇发酵条件的优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 主要试剂和溶液配制
• 3.2.4 主要仪器设备
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 葡萄糖发酵
• 3.3.2 蔗糖发酵
• 3.3.3 实验方法
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 分离菌株S16利用葡萄糖的发酵特性
• 3.4.2 分离菌株S16利用蔗糖发酵的特性
• 3.4.3 本章小结
• 第4章 分离菌株S16的糖蜜乙醇发酵应用
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 糖蜜
• 4.2.2 实验菌种
• 4.2.3 主要试剂和溶液配制
• 4.2.4 主要仪器和设备
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 糖蜜锤度的测定
• 4.3.2 糖蜜pH测定
• 4.3.3 糖蜜还原糖和总糖含量的测定
• 4.3.4 细胞干重的测定
• 4.3.5 乙醇的测定
• 4.3.6 糖蜜发酵的单因素实验
• 4.3.7 糖蜜发酵正交试验
• 4.3.8 糖蜜摇瓶发酵试验
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 甘蔗糖蜜主要指标的测定结果
• 4.4.2 糖浓度对糖蜜乙醇发酵的影响
• 4.4.3 氮源对糖蜜乙醇发酵的影响
• 4.4.4 酵母膏对糖蜜乙醇发酵的影响
• 4.4.5 磷酸盐对糖蜜乙醇发酵的影响
• 4.4.6 硫酸镁对糖蜜乙醇发酵的影响
• 4.4.7 糖蜜乙醇发酵正交试验
• 4.4.8 糖蜜摇瓶发酵试验
• 4.5 本章小结
• 第5章 甘蔗糖蜜发酵废液的回用
• 5.1 引言
• 5.2 实验材料
• 5.2.1 糖蜜乙醇废水
• 5.2.2 实验所用菌株
• 5.2.3 实验试剂
• 5.2.4 实验仪器以及设备
• 5.3 实验方法
• 5.3.1 糖蜜乙醇发酵废水回用技术
• 5.3.2 发酵液中乙醇浓度的测定
• 5.3.3 细胞干重的测定
• 5.3.4 统计学分析
• 5.4 结果与分析讨论
• 5.4.1 不同浓度乙醇废液添加量对细胞生长的影响
• 5.4.2 不同浓度乙醇废液添加量对乙醇产量的影响
• 5.5 本章小结
• 第6章 总结与展望
• 6.1 总结
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录 攻读硕士期间发表的论文和专利