遗传改造Streptomyces lincolnensis工业菌提高林可霉素A产量和纯度的初步研究

论文摘要

林可霉素及其半合成衍生物克林霉素是临床上广泛应用于抑制革兰氏阳性菌的两种林可酰胺类抗生素。我国林可霉素生产菌株发酵生产上却一直面临着有效组分林可霉素A产量不高和副产物林可霉素B含量偏高的问题。本文试图以提高林可霉素效价和削弱林可霉素B生物合成为切入点,以林可霉素工业生产菌S.lincolnensis N9为出发菌,增加林可霉素推定的甲基化基因orf25、orf12,调控基因orf22、orf29或整个生物合成基因簇1E8拷贝数的遗传改造,进行提高林可霉素A产量和纯度的初步研究。携带额外基因片段的突变菌均没有出现林可霉素产量大幅下降,说明对林可霉素工业生产菌进行遗传改造是可行的。其中,和对照菌S.lincolnensis N9相比,分别携带额外基因片段ermE*+orf25.ermE*+orf25+orf12、ermE*+orf22和林可霉素生物合成基因簇1E8的突变菌LIN-W、LIN-WJ、LIN-Q.LIN-1E8发酵液中林可霉素A产量分别提高了5.52%,13.75%,6.24%,17.3%；同时,突变菌LIN-WJ发酵液中林可霉素B含量由11.34%降为8.92%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写说明
• 第1章 前言
• 1.1 林可霉素简介
• 1.2 林可酰胺类抗生素的应用
• 1.3 林可霉素生物合成
• 1.3.1 林可霉素生物合成基因簇
• 1.3.2 林可霉素生物合成途径
• 1.3.3 林可霉素生物合成中推定的甲基化基因
• 1.3.4 林可霉素生物合成中推定的调控基因
• 1.4 PPL支路途径相关的抗生素
• 1.5 立题依据及研究内容
• 1.5.1 立题依据
• 1.5.2 研究内容
• 第2章 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 药品及试剂
• 2.1.5 主要溶液和缓冲液
• 2.1.6 培养基及培养条件
• 2.1.7 抗生素及其使用浓度
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种的培养和保藏
• 2.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.3 大肠杆菌质粒转化
• 2.2.4 大肠杆菌质粒DNA的提取（UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒）
• 2.2.5 DNA片段的回收（XA014-2B DNA片段快速纯化回收试剂盒）
• 2.2.6 DNA的酶切
• 2.2.7 质粒与外源片段的连接
• 2.2.8 PCR反应
• 2.2.9 S.lincolnensis总DNA的提取
• 2.2.10 大肠杆菌与S.lincolnensis属间接合转移
• 2.2.11 发酵验证突变菌的获得
• 2.2.12 S.lincolnensis出发菌及突变菌的发酵
• 2.2.13 杯碟法测定发酵液生物效价单位
• 2.2.14 发酵液的HPLC及LC-MS分析
• 第3章 倍增基因orf25、orf12提高林可霉素A产量和纯度的初步研究
• 3.1 甲基化基因orf25、orf12的双中断
• 3.1.1 突变菌LIN-DWJ的获得和验证
• 3.1.2 突变菌LIN-DWJ的发酵验证
• 3.2 甲基化基因orf25的单独倍增
• 3.2.1 携带甲基化基因orf25重组质粒的构建
• 3.2.2 突变菌LIN-W的获得和验证
• 3.2.3 突变菌LIN-W的发酵验证
• 3.3 甲基化基因orf25、orf12的共同倍增
• 3.3.1 携带甲基化基因orf25和orf12的重组质粒的构建
• 3.3.2 突变菌LIN-WJ的获得和验证
• 3.3.3 突变菌LIN-WJ的发酵验证
• 3.4 本章小结
• 第4章 倍增基因orf22、orf29和基因簇1E8提高林可霉素A产量和纯度的初步研究
• 4.1 调控基因orf22的单独倍增
• 4.1.1 携带调控基因orf22的重组质粒的构建
• 4.1.2 突变菌LIN-Q的获得和验证
• 4.1.3 突变菌LIN-Q的发酵验证
• 4.2 调控基因orf29的单独倍增
• 4.2.1 携带调控基因orf29的重组质粒的构建
• 4.2.2 突变菌LIN-U的获得和验证
• 4.2.3 突变菌LIN-U的发酵验证
• 4.3 基因簇1E8的单独倍增
• 4.3.1 突变株L1N-1E8的获得和验证
• 4.3.2 突变株LIN-1E8的发酵验证
• 4.4 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录一
• 附录二
• 附录三
• 附录四
• 附录五
• 附录六
• 附录七
• 附录八