论文摘要
肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药（Multidrug resistance,MDR）是制约临床肿瘤治疗有效性的主要原因之一。MDR形成机制复杂,其中ABC转运泵蛋白介导的药物外排作用是广泛存在的主要耐药机制。但越来越多的研究表明:药物作用同时激活肿瘤部位多种基因,多种分子机制协同参与耐药表型的形成,即多因素耐药。例如,化学抑制剂或特异性反义核酸和siRNA作用于以ABC转运泵蛋白过表达为耐药表型的肿瘤细胞,尽管完全抑制转运蛋白的表达,但不能相应恢复耐药细胞对化疗药的敏感性,提示多因素耐药机制共存。同时,多种耐药逆转剂的临床应用一直未取得显著性进展,部分原因可归结为这些针对单个肿瘤耐药因素的治疗尽管有效抑制其中某个特定机制,却不能影响其他共存的耐药机制的作用,因而不能完全逆转耐药。鉴于此,发现新的MDR相关蛋白,对进一步认识和理解肿瘤耐药发生的潜在分子机制,以及为临床克服肿瘤耐药提供新的诊断和治疗靶点,均具有重要意义。此外,特异定位于细胞膜表面的膜蛋白作为疾病诊断和治疗的靶点,尤其作为肿瘤表面标志物应用于肿瘤靶向治疗具有一定优越性。例如,单克隆抗体是目前一大类有效且应用广泛的肿瘤诊断及靶向治疗剂。与胞浆抗原蛋白相比,膜蛋白暴露于细胞外表面因而更易被单抗所识别、交联进而发挥细胞毒作用。因此,本文的研究集中于寻找耐药肿瘤细胞膜表面的MDR分子及其与MDR的相关性,进而探讨以此蛋白为靶点进行逆转MDR治疗的可行性。首先,发现并鉴定耐药细胞特定表达的MDR相关膜蛋白。目前能够进行高通量筛选的cDNAMicroarray和大规模蛋白质组学已成功用于差异蛋白的表达分析,但由于膜蛋白疏水性和表达丰度低等结构特性的限制,这些方法在膜蛋白分析中的效果有限。因此,本文采用同样基于质谱分析的方法,但与这些直接差异筛选不同的新策略。我们以一株经米托蒽醌（Mitoxantrone,MX）体外诱导产生的、乳腺癌耐药蛋白（Breast Cancer Resistant Protein,BCRP）过表达的乳腺癌多药耐药细胞MCF-7/MX作为模型。用完整的MCF-7/MX活细胞免疫Balb/C小鼠,得到能特异识别耐药细胞膜表面抗原的杂交瘤细胞库;通过对MCF-7敏感和MCF-7/MX耐药细胞的选择性筛选,获得与两者结合能力不同的单克隆抗体,这些抗体携带特定的耐药蛋白标识信息;进而通过免疫沉淀分离出在敏感和耐药细胞差异表达的靶蛋白,经MALDI-TOF-MS/MS二级质谱鉴定及一系列细胞生物学和生化方法验证,最后明确差异表达的蛋白为角蛋白8（Cytokeratin 8,CK8）;尤为重要的是,激光共聚焦显微镜观察到CK8特异性的细胞膜定位;用CK8 siRNA干扰后,耐药细胞膜表面CK8的过度表达显著抑制,有力说明我们的结论:CK8表达于细胞膜表面,且在耐药细胞MCF-7/MX表达水平增加。因此,抗体差异筛选联合质谱鉴定用于寻找细胞差异表达蛋白的方法是有效的,为发现特定细胞表面标志及肿瘤相关蛋白等提供了新思路。同时,我们也获得特异性识别膜蛋白CK8的单抗9C6,尽管不具备抗体中和活性,但有很强的细胞结合能力,为膜蛋白CK8的功能研究提供手段:并且9C6没有细胞毒性,有可能作为载体,与放射性同位素、前药或生物毒素等形成偶联物,靶向杀伤耐药肿瘤细胞,用于免疫治疗。到目前为止,尽管很多研究已明确角蛋白CK8能定位于某些肿瘤细胞膜表面,但膜蛋白CK8的生理或病理性功能却未知。本文首次发现CK8在耐药的肿瘤细胞膜表面过度表达,直接将膜CK8和肿瘤耐药性相联系,并进一步探讨了膜蛋白CK8过表达与肿瘤耐药的相关性。我们用针对CK8三个靶位点的siRNAs特异抑制MCF-7/MX细胞膜蛋白CK8的过表达后,细胞对化疗药米托蒽醌、拓扑替康和柔红霉素的敏感性分别增加了40.2%,33.0%和62.2%,（P＜0.01）;同时转染CK8表达载体在小鼠成纤维细胞NIH3T3获得外源性CK8表达,导致NIH3T3细胞对米托蒽醌产生耐药性,耐药倍数达到33倍,这些结果初步证实膜蛋白CK8过表达与乳腺癌细胞的耐药性相关。我们进一步对膜蛋白CK8参与肿瘤耐药的可能机制进行研究,发现耐药细胞MCF-7/MX对纤维粘连蛋白（Fibronectin）和玻璃粘连蛋白（Vibronectin）的粘附能力比MCF-7敏感细胞显著增强。更为有趣的是,抑制CK8的表达显著降低耐药细胞对Fibronectin和Vibronectin的粘附性,而对敏感细胞的粘附性却没有影响;为排除胞浆CK8的干扰,以膜蛋白CK8表达阴性的HEK293细胞作为对照。HEK293细胞转染CK8 siRNAs后粘附性并不发生改变,特异性说明是膜蛋白CK8导致耐药细胞粘附性发生改变。至此,我们的研究发现膜蛋白CK8的另一个新的功能:参与细胞粘附,且在耐药细胞的粘附性增加中起重要作用。而细胞之间或细胞与细胞外基质间粘附性的改变在肿瘤耐药的发生、维持中起重要作用,这一类耐药机制称为“粘附耐药”（Adhesion-mediateddrug resistance,CAM-DR）。我们推断在米托蒽醌药物长期诱导选择下,CK8在耐药细胞膜表面过量表达,增加细胞与细胞外基质的粘附能力,继而使耐药细胞通过改变粘附性而形成部分耐药表型。但是膜蛋白CK8如何直接作用或通过与其他分子如粘附蛋白等相互作用而间接影响耐药细胞的粘附性,目前尚不明确,有待进一步阐明。由于CK8表达水平和细胞定位的改变,与BCRP表达增加共存于耐药肿瘤细胞MCF-7/MX中,我们又从蛋白表达水平和功能角度,考察这两种蛋白之间是否有关联,以及两者以何种作用方式参与耐药表型的形成。结果发现,转染CK8 siRNA并不能改变BCRP的表达水平,反之亦然;与转运蛋白BCRP通过药物外排作用导致细胞耐药不同,CK8并不能影响MCF-7/MX细胞内药物蓄积。说明CK8过表达在肿瘤细胞耐药中起直接作用,独立于其他MDR相关分子的改变,包括BCRP的高表达。继而分别通过共转染CK8和BCRP表达载体以及siRNA双干扰抑制CK8和BCRP表达的方法,以观察CK8和BCRP同时获得表达或表达缺失对细胞耐药性的影响。结果表明,CK8和BCRP以协同作用方式通过多因素耐药机制参与耐药表型的形成。为明确以CK8和BCRP作为多靶点治疗耐药肿瘤的可行性,我们采用短发夹状shRNA干扰载体作为可能的基因治疗手段,通过脂质体转染将CK8和BCRP的干扰载体同时导入MCF-7/MX细胞,经稳定筛选,分析细胞耐药性的改变。结果发现,尽管单独抑制CK8或BCRP可以有效逆转耐药性,但同时干扰两者的共表达,能更显著恢复耐药细胞对化疗药的敏感性。这些体外实验结果初步证实:针对CK8或BCRP特异性的干扰载体具有明显的肿瘤耐药抑制活性,值得进一步的体内研究:同时,针对多靶点的双干扰质粒很有可能成为逆转肿瘤耐药更为有效的手段。综上所述,本文通过一系列研究从肿瘤耐药相关膜蛋白分子的发现、鉴定、功能验证以及初步机制探讨等方面,证实CK8在耐药细胞膜表面的过表达与肿瘤多药耐药性相关。膜蛋白CK8作为新的耐药相关的膜表面标志,有可能成为逆转肿瘤耐药诊断和治疗的新靶标。同时明确CK8和BCRP通过多因素耐药机制共同参与MCF-7/MX细胞耐药表型的形成,并为针对多因素耐药,采取多靶点治疗而逆转耐药提供了实验基础。