不吸水链霉菌基因转移系统的建立及嘧肽霉素生物合成基因的研究

论文摘要

嘧肽霉素是本研究室研发的具有自主知识产权的新型抗病毒农用抗生素,由不吸水链霉菌辽宁变种（Streptomyces ahygroscopicus var.Liaoningensis）产生,对多种植物病毒病害、真菌病害都有很高的防效,为了从分子生物学角度研究嘧肽霉素的生物合成,本文建立了不吸水链霉菌的遗传转移系统,克隆获得了嘧肽霉素的部分生物合成相关基因,并对其功能进行了研究,获得的结果如下:1.利用紫外诱变方法,获得了1株嘧肽霉素生物合成阻断突变株UV2136和1株嘧肽霉素高产菌株,前者为互补克隆策略研究嘧肽霉素生物合成基因提供了转化受体,后者为嘧肽霉素的生产提供了高产菌株。2.针对嘧肽霉素的生物合成阻断突变株UV2136,本文研究了其最佳的菌体培养、原生质体制备和再生条件。采用改良的含15%蔗糖、0.5%甘氨酸的YEME液体培养基振荡培养36h,获得细腻丰富的菌丝体;对不同的酶浓度、酶解温度和酶解时间进行3因子4水平的正交试验,筛选最佳酶解条件为:溶菌酶浓度2mg/ml,28℃,作用90min,可获得最高的制备率99%;再生培养基以R2YE为最佳,采取直接涂布方式,25.5℃培养可达到48%的再生率;3.利用原生质体转化法建立了嘧肽霉素生物合成阻断突变株的质粒转移系统,本试验为后续的互补克隆提供了方法,也是首次建立不吸水链霉菌的基因转移系统。UV2136对硫链丝菌素高度敏感,选择含有该抗生素标记的质粒pIJ702和pWHM3,探索其转化UV2136的可能性。结果表明,UV2136含有较强的限制修饰系统,采取热衰减法获得原生质体、原生质体热处理、冷处理、EDTA处理、质粒DNA变性等,均不能实现质粒pIJ702向UV2136的转化。来自非甲基化宿主E.coli ET12567的pWHM3也无法实现转化,而源于E.coli DH5α的甲基化pWHM3,可以低频转化菌株UV2136,转化效率为4转化子/μg pWHM3,经UV2136自身修饰的pWHM3可实现高效转化,达到104转化子/μg pWHM3。4.利用接合转移实现了温敏感型质粒向不吸水链霉菌辽宁变种的转化,为研究嘧肽霉素生物合成相关基因的功能分析提供了载体。利用BclI酶切质粒pIJ702,回收其中含有硫链丝菌素抗性基因的1,055bp的BclI-BclI片段,插入质粒pKC1139的BglⅡ位点,构建pKC1139-tsr质粒;设计引物,以pIJ702为模板扩增了其中含硫链丝菌素的目的基因,经ApaI、NheI双酶切,插入到pSET152的ApaI-NheI酶切位点,构建pSET152-tsr质粒;pKC1139-tsr质粒可通过接合转移实验转入不吸水链霉菌辽宁变种,为后续的基因功能研究提供了载体,但pSET152-tsr质粒不能倒入,表明嘧肽霉素产生菌中可能不含有attp位点。5.采用互补克隆策略获得了3个可能的嘧肽霉素生物合成相关基因,cytoA、cytoB和cytoC,cytoA、B分别编码双组分系统的传感激酶和反应调节因子,cytoC编码保守假定蛋白,并分别对其进行了功能研究,表明cytoA、B可能参与嘧肽霉素生物合成的调控,cytoC直接参与嘧肽霉素的生物合成。利用EcoRI、HindⅢ对野生型菌株04-2-2基因组DNA进行不完全酶切,回收3-15kb DNA片断,分别与经EcoRI、HindⅢ酶切的pWHM3连接,转化嘧肽霉素生物合成阻断突变株,筛选硫链丝菌素抗性菌落,对其进行嘧肽霉素活性测定,从EcoRI酶切产物中获得1个恢复嘧肽霉素产生能力的克隆,定名为UV2136-R,对其中的插入片段进行分析,结果表明,该片断含有3个开放阅读框,分别定名为cytoA、cytoB和cytoC。其中,cytoA大小为1464bp,编码一个由487个氨基酸残基组成的蛋白质,数据库比较结果表明cytoA编码的氨基酸序列属于组氨酸蛋白激酶超家族,与始旋链霉菌中的传感激酶有较高的同源性,一致性可达66%,说明cytoA的编码产物可能为组氨酸激酶;cytoB大小为570bp,编码一个由189个氨基酸残基组成的蛋白质,数据库比较结果表明cytoB编码的氨基酸序列与灰色链霉菌中的反应调节因子有很高的同源性,一致性可达86%,表明cytoB的编码产物为反应调节因子,与cytoB编码的传感激酶共同组成二组分系统,基因登陆号为GQ149124,两者的阻断使嘧肽霉素的产生能力降低,可能为正调控基因;cytoC大小为783bp,基因登陆号为GQ250103,编码一个由260个氨基酸残基组成的蛋白质,数据库比较结果表明,cytoC的编码产物属于DUF899超家族,与固氮菌和始旋链霉菌中的保守假定蛋白的同源性高,一致性可达85%,该假定蛋白与硫氧环蛋白相似,其阻断使菌株丧失嘧肽霉素产生能力,说明其是参与嘧肽霉素生物合成的一个重要基因。6.利用同源克隆获得了一个嘧肽霉素生物合成基因cytoD,可能编码葡萄糖基转移酶,功能验证表明其直接参与嘧肽霉素的生物合成。嘧肽霉素与杀稻瘟菌素S有相同的组成部分,即胞啶咛,推知可能有相同或相近功能的生物合成基因存在,以灰色产色链霉菌中催化胞啶咛合成的blsD基因的部分序列为探针,对嘧肽霉素产生菌04-2-2的完全酶切片段进行Southern杂交,从XbaI完全酶切的基因组DNA中获得一条2.1kb左右的杂交片段,利用基因小库构建、菌落原位杂交等克隆得到了含有杂交片段的菌落,其中的质粒定名为pUC18-CGA,测序结果表明其中含有1个完整的开放阅读框,cytoD由981bp组成,编码326aa组成的蛋白质,Blast结果表明,其编码产物与灰色链霉菌中的葡萄糖基转移酶有较高的同源性,一致性可达85%,说明cytoD可能为葡萄糖基转移酶基因。cytoD的阻断使菌株丧失嘧肽霉素产生能力,说明其是参与嘧肽霉素生物合成的一个重要基因。以上工作对克隆获得完整的嘧肽霉素生物合成基因簇、研究嘧肽霉素的生物合成途径具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 抗生素生物合成的分子生物学研究进展
• 1.1 抗生素生物合成相关基因的研究策略
• 1.2 链霉菌抗生素生物合成基因的功能分析
• 1.3 抗生素生物合成基因簇的研究进展
• 1.4 组合生物合成简介
• 1.5 嘧肽霉素的介绍
• 第二章 不吸水链霉菌辽宁变种的紫外诱变
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 野生型嘧肽霉素产生菌的紫外诱变
• 2.2 不产素突变株的形态变化
• 2.3 不产素突变株的传代稳定性
• 2.4 高产菌株的选育
• 2.5 发酵液活性测定
• 2.6 突变菌株的分子生物学验证
• 3 小结
• 第三章 原生质体法建立不吸水链霉菌的质粒转化系统
• 第一节 突变株UV2136原生质体的制备和再生
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 菌丝生长适宜条件的选择
• 2.2 酶解系统适宜条件的选择
• 2.3 再生条件的选择
• 3 小结
• 第二节 突变株UV2136转化系统的建立和优化
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 突变株UV2136抗药性标记的筛选
• 2.2 质粒pIJ702向突变株UV2136的转化
• 2.3 大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pWHM3向突变株UV2136的转化
• 3 小结
• 第四章 接合转移在不吸水链霉菌中的应用
• 第一节 接合转移质粒载体的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株04-2-2的抗药性分析
• 2.2 pKC1139-tsr的构建
• 2.3 pSET152-tsr的构建
• 3 小结
• 第二节 接合转移在不吸水链霉菌辽宁变种中的应用
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 pKC1139-tsr向不吸水链霉菌辽宁变种的转化
• 2.2 pSET152-tsr不能转化不吸水链霉菌辽宁变种
• 3 小结
• 第五章 嘧肽霉素生物合成基因CytoA、B、C的克隆和功能分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 链霉菌基因组DNA最佳酶切条件的摸索
• 2.2 含互补基因的转化子的获得
• 2.3 插入片段的获得
• 2.4 插入片断的序列分析
• 2.5 克隆基因的功能分析
• 3 小结
• 第六章 cytoD的克隆和功能分析
• 1 材料与方法
• 2 结果与分析
• 2.1 CGA合酶基因片段的获得
• 2.2 利用地高辛标记检测不吸水链霉菌中的同源片段
• 2.3 不吸水链霉菌中CGA合酶基因同源片段的克隆
• 2.4 不吸水链霉菌中CGA合酶基因同源片段的序列分析
• 2.5 生物合成相关基因cytoD的功能分析
• 3 小节
• 第七章 结论与讨论
• 1 嘧肽霉素的紫外诱变
• 2 嘧肽霉素生物合成阻断突变株的原生质体制备和再生
• 3 嘧肽霉素生物合成阻断突变株基因转移系统的建立
• 4 接合转移建立不吸水链霉菌辽宁变种的质粒转移系统
• 5 嘧肽霉素生物合成相关基因cytoA、cytoB、cytoC的克隆和功能分析
• 6 嘧肽霉素生物合成基因cytoD的克隆和序列分析
• 7 本论文的创新与不足之处
• 参考文献
• 致谢
• 附录