聚乳酸生物降解酶及其催化特性研究

论文摘要

石油基塑料作为材料产业的一大支柱,已经成为社会生活不可或缺的一部分,但随着白色污染的严重及石油资源的日益匮乏,其地位明显动摇,绿色高分子材料逐步受到青睐。目前开发的绿色高分子材料主要是聚酯类,其优势体现在具有生物可降解性和可再生性;而且,天然的或经过改性的聚酯具有和传统塑料相当甚至更优的机械性能和物理化学性能,能够满足人们社会生活的需求,其中聚乳酸（PLA）以其优良的物理化学性能和潜在的成本优势尤受人们的关注。目前相对于其它高分子材料,PLA已经以其性能和成本优势率先实现了大规模的产业化生产,成功地应用于医疗、纺织和包装等产业,被认为是最具潜力的替代现有塑料的新型“生态材料”之一。虽然PLA在性能和生产应用上与其它聚酯相比具有明显的优势,但其生物降解的研究却相对滞后。PLA在自然界中降解缓慢,发现的降解微生物和高效降解酶有一定的特殊性,这限制了针对PLA废弃物处理回收系统的开发,而没有成功的回收系统将无法实现PLA生产的物料循环。目前PLA的降解机理尚未阐明,这在很大程度上限制了可控降解材料的开发,也限制了PLA材料的推广和应用,只有强化PLA的快速降解性和完全降解性机理的研究,才能够真正实现其环境友好化。因此,本文从PLA降解菌株出发,研究了PLA降解酶的性质及催化特性,从酶催化机理及进化分析的角度对PLA的降解机制进行了探讨。本文主要的工作内容及结果如下:1.通过对土壤样品和菌种库菌种的筛选,获得了一株高效降解PLA的菌株——Amycolatopsis orientalis。自然界中降解PLA的菌株十分有限,主要集中在稀有放线菌中。本文通过土壤和菌种库的筛选获得了对PLA具有降解作用的菌株,并以其中降解能力相对高效的Amycolatopsis orientalis为研究对象,进行了降解性能的评价和表征,证实该菌株可以以PLA为唯一碳源进行生长,吸收降解产物乳酸。诱导实验结果显示该菌株分泌产生诱导型的PLA降解酶,除了PLA以外,蛋白类物质（明胶、蚕丝、蛋白胨等）也可以高效的诱导PLA降解酶的产生,推测降解酶与蛋白酶类存在着一定的相关性。通过比较,确定选择明胶为最佳诱导物进行下一步的诱导产酶。2.从Amycolatopsis orientalis发酵液中同时分离到了三种对PLA具有高效降解作用的降解酶。目前国际上报道的从聚乳酸降解菌株中分离得到的降解酶只有3个,并且均为单酶组分。本文首次利用离子交换、疏水层析、分子筛层析等分离方法从Amycolatopsis orientalis发酵液中分离到了三种对PLA具有高效降解作用的降解酶,并对其催化特性进行了系统的研究。研究发现三种降解酶的分子量分别为24.0、19.5和18.0 kDa,且均为碱性蛋白。活性比较及动力学参数分析都显示出这些降解酶对PLA的降解活性均比PLA的代表性降解酶——蛋白酶K要高。除了对PLA具有降解作用以外,这些PLA降解酶对蛋白及小肽类物质也都具有降解活性,且受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF的强烈抑制,从催化特性上分析该酶可能属于丝氨酸蛋白酶。MALDI-TOF肽指纹图谱分析结果显示,三个降解酶的胰酶酶解峰各不相同,可能不是来源于同一前体,而是独立的降解酶组分;质谱结果的数据库比对没有找到匹配程度较高的蛋白,暗示这些降解酶可能是没有经过系统研究的新的酶类。3.利用降解酶生化信息克隆到两个PLA降解酶基因,并初步实现了其异源表达。目前仅有两篇文章报道了PLA降解酶基因的相关信息,一篇是通过基因组文库进行功能筛选获得其基因,另一篇是通过对降解酶进行有限酶解后测序设计相应探针从基因组文库中获取相关基因。本文根据降解酶具有丝氨酸蛋白酶的生化性质,推测其具有保守的丝氨酸位点,根据保守位点序列及酶的N端测序结果设计引物,PCR扩增部分基因序列,然后通过一种新兴的染色体步移技术——SEAF-PCR克隆全长基因,获得了两个降解酶PLAaseⅡ和PLAaseⅢ的基因序列;同时,将PLA降解酶基因分别在大肠杆菌及枯草芽孢杆菌中进行了表达,获得了具有活性的重组表达蛋白,初步建立了PLA降解酶的表达体系,从而为深入精细地研究其功能机制奠定了基础。4.序列比对及同源模建揭示了PLA降解酶结构的特殊性。通过网上数据库及一系列生物信息学软件对降解酶的结构进行了分析。结果显示,PLAase2和PLAase3属于丝氨酸蛋白酶家族的S1A亚族,具有丝氨酸蛋白酶的保守结构域,三联体活性中心并未发生明显变化,分别对应于PLAase2的H71、D103、S190和PLAase3的H32、D58、S135;而且其整体结构也和蛋白酶家族中的其它酶一样具有两个β桶结构域,活性中心处于两个桶之间的裂缝中;对胰凝乳蛋白酶极性环境的稳定性和氧负离子洞形成十分重要的S214残基和G193残基也都存在,分别对应于PLAase2中的S215、G188和PLAase3中的S150、G133。但PLAase2和PLAase3的底物结合口袋具有明显的特异性,关键的216位和226位氨基酸与家族中其它成员的不同;被认为在P1口袋处形成二硫键为洞穴提供刚性的C191和C220,及包含了Ca结合位点E70和E80残基,在PLAase2和PLAase3中都不存在。这些结果暗示可能正是由于这些差异性导致了PLAase2和PLAase3结构与其它丝氨酸蛋白酶的不同,其P1结合口袋可能具有更大的柔性从而造成了特殊的底物特异性,使降解酶更容易与PLA结合。同时本文利用InsightⅡ模建软件,对PLAase2和PLAase3及目前NCBI中收录的PLA降解酶序列进行了同源模建,结果显示这些PLA降解酶在骨架结构上与模板酶没有明显的差别,发生变化的部分主要在于S1底物结合口袋及表面的loop区,而这些位置已经被证明与酶的底物特异性密切相关,因此推测这些区域可能是使PLA降解酶具有特殊活性的关键结构。另外,系统发育树分析还显示出,这些降解酶只与高GC含量的革兰氏阳性菌的丝氨酸蛋白酶同源性较高（50%左右）,除保守位点外,其它区域序列与家族中其它成员相比相似性很低,推测PLA降解酶处于独特的进化地位,具有“古老”的蛋白酶骨架,而催化活性相关部位具有较高的可塑性。对PLA降解酶系统的深入研究对于揭示这一类特殊酶的功能和进化地位具有重大意义。5.对降解酶降解PLA的机制进行了探讨。基于上述分析结果,对PLA的降解机制进行了探讨,提出了PLA与天然蛋白质结构上的类似性为PLA的降解提供了充分条件;特殊酶的存在是PLA降解的必要条件。推测这类降解酶对PLA具有降解作用不只因为其具有蛋白酶保守的活性位点,更关键的在于其底物结合口袋及表而loop区的特殊性,使酶具有了更为广泛的底物特异性,从而能够对PLA进行催化降解。由此还可以预测,这种具有较高催化可塑性的“原始”酶与进化地位较高的专一性酶相比,具有更大的工程改造潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表（ABBREVIATION）
• 第一章 绪论
• 1.1 PLA的研究历史
• 1.2 PLA的结构、性能及应用
• 1.3 PLA的合成及生产
• 1.4 PLA的降解研究
• 1.4.1 PLA的水解及影响因素
• 1.4.2 PLA的生物降解
• 1.5 蛋白酶及其研究进展
• 1.5.1 蛋白酶及其分类
• 1.5.2 蛋白酶作用机理
• 1.6 论文的立题依据及工作内容
• 第二章 PLA降解菌株的筛选及其PLA降解特性的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 样品采集
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 菌种活化
• 2.1.6 菌种筛选
• 2.1.7 菌种鉴定
• 2.1.8 PLA降解能力验证及表征
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 菌种的筛选
• 2.2.2 菌种鉴定
• 2.2.3 Amy对PLA降解能力的验证及表征
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 PLA降解酶的分离纯化及性质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种及培养
• 3.1.2 主要试剂及仪器
• 3.1.3 PLA降解酶的诱导表达
• 3.1.4 发酵进程测定
• 3.1.5 酶的分离纯化
• 3.1.6 酶活检测方法
• 3.1.7 其它分析方法
• 3.1.8 PLA降解酶组分鉴定及其酶学性质分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 PLA降解酶酶学本质的确定
• 3.2.2 PLA降解酶的诱导表达及发酵
• 3.2.3 PLA降解酶的分离纯化
• 3.2.4 PLA降解酶组分鉴定及其酶学性质研究
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 PLA降解酶基因的克隆及表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株及质粒
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 主要仪器
• 4.2 方法
• 4.2.1 基因的克隆
• 4.2.2 蛋白的异源表达
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 全基因的克隆
• 4.3.2 plaase2种plaase3在大肠杆菌中的表达
• 4.3.3 plaase2和plaase3在枯草杆菌中的表达
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 PLA降解酶序列分析及结构预测
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 使用的数据库及软件
• 5.1.3 方法
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 理化性质分析
• 5.2.2 氨基酸序列的比对
• 5.2.3 蛋白结构域分析
• 5.2.4 蛋白二级结构的预测
• 5.2.5 序列及进化分析
• 5.2.6 同源模建
• 5.3 小结与讨论
• 第六章 PLA降解酶作用机制的探讨
• 6.1 PLA生物降解的充分条件
• 6.2 PLA生物降解的必要条件
• 6.3 PLA降解酶特殊结构功能预测及机制分析
• 6.4 PLA降解酶的进化地位
• 6.5 由PLA降解酶产生的思考
• 6.6 小结与讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 外文写作一
• 外文写作二