导读:本文包含了昆虫细胞表达系统论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:PLCζ蛋白,昆虫细胞,杆状病毒表达系统,表达
昆虫细胞表达系统论文文献综述
陈鑫,胡玥玥,徐鸿毅,王晓燕,邓锴[1]（2019）在《重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定》一文中研究指出PLCζ是PLC家族的一种新型同工酶,在哺乳动物卵母细胞激活中起着极其重要的作用。近年来,体外大量表达和纯化有活性的PLCζ蛋白用于结构生物学研究一直未能获得成功。本研究首次在杆状病毒表达系统中表达和纯化重组人PLCζ蛋白,首先将人PLCζ基因克隆至pFastBac-HTA质粒构建重组载体,转化DH10Bac发生位点特异性转座,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒Bacmid-PLCζ;在脂质体介导下将穿梭质粒转染Sf9昆虫细胞产生重组病毒,扩增病毒感染Sf9昆虫细胞进行蛋白表达;利用Ni~(2+)亲和柱及分子筛来纯化蛋白,并通过考马斯亮蓝染色、Western blotting及飞行时间质谱对蛋白进行鉴定,并进行酶活性测定。结果显示重组蛋白在Sf9昆虫细胞感染杆状病毒后72 h达到峰值并以分泌形式表达在细胞培养基中,Ni~(2+)亲和柱及分子筛纯化后的重组蛋白经Western blotting及电离飞行时间质谱鉴定为PLCζ蛋白,酶活性可达326.8 U/mL。该实验结果为重组人PLCζ蛋白大规模生产和生物医学应用研究提供了可参考利用的技术。(本文来源于《生物工程学报》期刊2019年06期）
白鹭[2]（2017）在《HPV16病毒样颗粒疫苗在昆虫细胞表达系统中的优化表达》一文中研究指出HPV对于大多数女性而言,是一过性感染,大约80%的女性一生之中至少要感染一次HPV,在其引起细胞发生异常改变之前可以通过人体自身免疫力将它完全清除,不会对健康构成危害,也无法进行检测据研究结果表明,自从首次在宫颈癌组织中发现了HPV,则证实大约15种高危基因型HPV持续感染宫颈可以导致宫颈癌,癌前损害以及3级宫颈上皮内瘤病变(CIN3)、原位腺癌(AIS)。伴随着现代基因工程技术的飞速发展,已经建立了很多种异源蛋白的表达系统。昆虫细胞-杆状病毒表达系统自二十世纪八十年代问世,至今已不断改进完善,是重组蛋白表达技术的重要组成部分。与哺乳细胞的表达系统相比,昆虫细胞的表达量高,培养方式多样,且安全性好,具有广泛的应用。本文着重研究在昆虫细胞表达系统中,病毒的不同病毒感染复数(MOI)、不同的细胞感染密度(DOI)、不同细胞收获时间(TOH)对与HPV16L1的表达的影响。HPV16L1的构建表达:通过PCR合成16L1的基因,按照去除核定位信号设计PCR引物扩增截短型HPV16型目的基因,测序无误后重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒p Fast Bac TM1,将目的基因片段重组入Bacmid基因组,提取重组的Bacmid DNA,M13引物PCR鉴定正确,将重组的杆状病毒Bacmid-HPVL1用转染的方法转染sf9细胞大量感染昆虫细胞后获得P1,P1继续感染细胞获得P2,依次类推,获得大量P4代滴度稳定的毒种原液。在确定毒种能在昆虫细胞中稳定表达后,设计以下叁个优化表达的实验,⑴对病毒不同感染复数(MOI)的摸索:将细胞的接种密度(DOI)定在2.5×106个/ml,加毒后的第72小时收获,用不同的病毒感染复数(MOI)分别在昆虫细胞中表达后,收获细胞进行SDS电泳鉴定,确定最佳的病毒MOI;⑵对不同的细胞感染密度(DOI)的摸索:选取病毒感染复数(MOI)为0.5,加毒后的第72小时收获,用不同的细胞的感染密度(DOI)中接种毒种,在昆虫细胞中表达后,收获细胞进行SDS电泳鉴定,确定最佳细胞感染密度(DOI);⑶对不同收获时间(TOH)的摸索:选取病毒感染复数(MOI)为0.5,细胞的感染密度(DOI)定在2.5×106个/ml,接毒后按时间段分别取样收获后进行SDS电泳鉴定,确定最佳的收获时间。通过上述叁个优化实验后,确定HPV16L1在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的最佳表达参数,在病毒感染复数(MOI)为0.5,细胞感染密度(DOI)在2.5×106个/ml,在感染细胞后72小时收获,HPV16L1在昆虫细胞中的表达量可达到150μg/ml,大量表达后进行超速离心纯化,通过免疫小鼠获得血清,应用假病毒中和抗体实验来检验免疫原性。本文通过对HPV生产工艺的初步研究,对未来生物制品在工业上的生产放大有一定指导意义。(本文来源于《吉林大学》期刊2017-12-01）
李岭,王化磊,曹增国,金宏丽,郑学星[3]（2015）在《西尼罗病毒E蛋白在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的表达及其鉴定》一文中研究指出目的利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统表达西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)囊膜E蛋白,并进行鉴定。方法利用分子克隆技术将WNV E基因克隆至杆状病毒供体质粒p Fast Bac1中,构建重组供体质粒p Fast Bac-E,转化大肠埃希菌DH10Bac,构建重组穿梭质粒Bac-E,转染sf9细胞,收获含WNV E基因的重组杆状病毒Ac MNPV-E,采用间接免疫荧光及Western blot法检测E蛋白的表达。结果重组供体质粒p Fast Bac-E经PCR及双酶切鉴定证明构建正确,重组穿梭质粒Bac-E经PCR鉴定证明构建正确,转染约96 h后,sf9细胞体积变大、变圆,细胞颗粒化,进而从培养板上脱落,漂浮,收获的第1代Ac MNPV-E经PCR鉴定为阳性。感染重组杆状病毒Ac MNPV-E的sf9细胞周围出现绿色荧光,表达的目的蛋白可与兔抗WNV E蛋白多克隆抗体及鼠抗His单克隆抗体特异性结合,在相对分子质量约53 000处可见目的蛋白条带。结论利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统成功表达了WNV E蛋白,为WNV快速诊断方法及新型疫苗的建立奠定了基础。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2015年02期）
卢慧,刁华,肖玉芳,于合国,李铮[4]（2014）在《昆虫细胞杆状病毒表达系统表达重组人类ZP3蛋白的研究》一文中研究指出目的:探讨利用重组表达系统制备重组人类ZP3(h ZP3)蛋白的方法和技术难点,为h ZP3蛋白的制备和应用打下技术基础。方法:构建h ZP3的载体质粒p FASTBAC HTa-h ZP3,在大肠杆菌宿主细胞中利用杆状病毒Bac-to-Bac系统同源重组构建重组的杆状病毒穿梭载体Bacmid,用重组的Bacmid转染Sf9细胞制备重组杆状病毒,分别表达带HIS标签的h ZP3全长蛋白(氨基酸1~424)和截短的h ZP3蛋白(氨基酸23~348)。摸索重组h ZP3蛋白的表达时间和纯化制备方法。结果:成功制备了表达重组人h ZP3全长蛋白和截短体蛋白的Bacmid和杆状病毒颗粒,Western印迹检测表明,在Sf9细胞中较好的表达时间段为感染后72~96 h。重组表达的h ZP3蛋白可以部分被钴柱亲和纯化,大量的重组h ZP3蛋白不能结合到亲和介质而流穿,但确切的原因还未知。纯化得到的h ZP3经荧光素Dylight Dye488标记,能与人精子结合。结论:利用昆虫细胞杆状病毒表达系统表达h ZP3蛋白是可行的,可以进一步优化,但h ZP3蛋白的有效富集和纯化方法是最大的瓶颈,还需要进一步摸索。(本文来源于《中华男科学杂志》期刊2014年11期）
李志红,Qiming,Jane,Wang[5]（2014）在《蛋白激酶D1催化结构域在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化和活性测定》一文中研究指出蛋白激酶D(Protein kinase D,PKD)是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)受体,参与细胞内多种生理生化过程。为获得高纯度的PKD1的催化结构域(PKD1-cat)用于晶体学结构的研究,将带有GST标签的PKD1-cat基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中,构建了重组质粒。将重组质粒转化到含穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,转座后获得了含目的基因GST-PKD1-cat的重组Bacmid。重组Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞后,获得重组杆状病毒并扩毒。将毒种以5 PFU/cell的感染复数感染悬浮培养的T.ni昆虫细胞,SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物。结果显示,表达产物在分子量约68 kDa处有一特异条带可与GST单克隆抗体发生反应。经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化和PreScission Protease切除GST标签后,得到了纯度很高的分子量约42 kDa的目的蛋白PKD1-cat。体外PKD激酶活性实验结果显示,随着PKD1-cat浓度的增加,激酶活性增高。这些结果显示截短的重组PKD1-cat有很高的催化活性和纯度,为采用核磁共振或晶体学方法解析PKD1-cat的叁维结构奠定了基础。(本文来源于《生物工程学报》期刊2014年08期）
谭婷,刘芸,罗海华,李翠,姜勇[6]（2014）在《Tat-Vp3融合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达与纯化及其促凋亡功能的研究》一文中研究指出目的:采用杆状病毒-昆虫细胞表达系统获取可溶性His-Tat-Vp3融合蛋白,并观察其对细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建重组质粒pFastBac~(TM)1-TAT-VP3,转化DH10Bac感受态细胞,获得杆状病毒质粒,转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒,纯化并扩增该病毒。用最适滴度的病毒刺激Sf9细胞以诱导His-Tat-Vp3蛋白表达,经SDS-PAGE和Western bolt鉴定,获得分子质量约21 kDa的融合蛋白。采用MTT实验与流式细胞技术检测500、1 000、2 000 nmol/L的融合蛋白抑制肿瘤细胞(HeLa细胞)增殖及促凋亡的活性。结果:通过昆虫表达系统成功表达及纯化出Tat-Vp3融合蛋白,其中1 000、2 000 nmol/L融合蛋白组可显着抑制肿瘤细胞的增殖,并提高细胞的凋亡率。结论:成功构建His-TAT-VP3融合蛋白昆虫系统表达载体,在昆虫表达系统中可诱导性可溶性高表达,所获融合蛋白能显着抑制HeLa细胞的增殖,并促进其凋亡。(本文来源于《感染、炎症、修复》期刊2014年01期）
万婧,相兴伟,江玲丽,周向阳[7]（2014）在《杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展》一文中研究指出真核细胞大部分生命活动是通过复合体催化的。因此,系统了解这些复合体的生物学功能,将在健康和疾病方面具有重要意义。由于内源性复合体存在低丰度和异质性特点,因而直接提取复合体存在一定的困难。杆状病毒-昆虫细胞表达系统可成功表达复合体,为研究复合体的结构和功能提供新的手段。综述近年来利用杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行蛋白质复合体结构和功能研究的进展。(本文来源于《生物技术通报》期刊2014年02期）
夏玉龙[8]（2013）在《应用昆虫细胞表达系统生产用于基因治疗的重组腺相关病毒的研究》一文中研究指出与其他病毒载体相比，腺相关病毒（adenovirus-associated virus, AAV）由于具有宿主范围广、病原性低和携带的治疗基因表达时间长等优势而成为目前最有前景的基因治疗载体之。尽管AAV载体具有众多优势，但AAV的生产是个比较繁琐的过程，涉及到的因素比较多，如何获得种简单而高产量的生产方式直是阻碍其在临床上应用的大瓶颈。随着科研人员的不断探索，AAV的生产方式经历了几个不同的发展阶段，因此AAV的生产成本在不断降低，产量却逐步提高，从而能够实现AAV规模化生产的目标。目前除腺病毒和单纯疱疹病毒外，杆状病毒也能为AAV的复制包装提供辅助功能，而且杆状病毒安全有效且不会感染人体。因此，利用杆状病毒携带AAV包装所需的顺式和反式作用元件，通过对昆虫细胞Sf9的感染，在昆虫细胞中生产重组AAV载体，是种较为理想的生产方式且能够规模化生产重组AAV。重组AAV生产的昆虫细胞表达系统需要两类反式因子和个顺式元件。反式因子包括AAV的复制和整合所需蛋白Rep78和Rep52，以及AAV衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。两类反式因子可由种杆状病毒携带。顺式元件为携带AAV的ITR及外源基因表达框（如EGFP），可由另重组杆状病毒提供。本研究，我们借助个能在昆虫细胞中起作用的包含昆虫多角体蛋白启动子的内含子，将AAV的rep和cap基因构建到同杆状病毒载体中，借助内含子的作用，Rep表达框能同时表达Rep78和Rep52，而Cap表达框能同时表达Cap1、Cap2和Cap3。此外，我们设计了另种生产AAV策略，即将rep和cap编码基因起始密码子进行突变，构建的杆状病毒载体也能够使Rep表达框能同时表达Rep78和Rep52，而Cap表达框能同时表达Cap1、Cap2和Cap3。根据AAV2的Rep和Cap基因序列设计引物，PCR扩增包括内含子的RepIN、CapIN和起始密码子突变的mRep、mCap。然后将RepIN和CapIN，mRep和mCapIN分别构建到同杆状病毒穿梭载体pFastBacDual中得到pFBD-RC和pFBD-mRC。将这两个载体分别转化DH10Bac~(TM)感受态细胞通过转座得到重组Bacmid，转染sf9细胞后生产出重组杆状病毒Bac-RC和Bac-mRC。采用类似的方法也得到重组杆状病毒Bac-EGFP和Bac-TRAIL。将Bac-RC和Bac-EGFP/Bac-TRAIL、Bac-mRC和Bac-EGFP/Bac-TRAIL分别共感染Sf9细胞构成二杆状病毒生产系统，可分别用来生产携带EGFP和TRAIL的重组病毒AAV-EGFP和AAV-TRAIL。研究初步表明，上述两种生产AAV的策略均能成功包装出AAV-EGFP和AAV-TRAIL病毒。生产出的病毒经AAV纯化试剂盒纯化，通过定量PCR检测病毒载体基因组产量，结果显示采用内含子连接的二状病毒系统生产重组AAV的能力为每个Sf9细胞1.32×10~4VG（Virus vector genomes，病毒载体基因组），而突变起始密码子的二杆状病毒则每个Sf9细胞产生2.1×10~3VG。可见Bac-RC与Bac-EGFP的二杆状病毒系统的生产能力更强。重组AAV-EGFP感染293A细胞后能观察到较强的绿色荧光表达，表明病毒活力较好。上述两种利用杆状病毒生产重组AAV的能力均较强，达到传统生产方法产量的10倍以上，后续如将其放大到较大规模的悬浮培养生产方式，产量和生产效率将得到极大提高。因此，杆状病毒生产重组AAV系统具有高效、安全、可放大特性并且生产过程简单，能够满足临床基因治疗对AAV产量的需求，且生产的AAV病毒与传统哺乳动物细胞生产的没有任何区别。(本文来源于《浙江理工大学》期刊2013-02-16）
覃宇翔,姚德生,高琨[9]（2011）在《OPCML基因在杆状病毒—昆虫细胞表达系统中的表达》一文中研究指出目的:利用杆状病毒表达系统行OPCML基因在Sf9昆虫细胞中表达。方法:以OPCML-PWPI为模板,利用PCR方法扩增OPCML基因,将OPCML基因连接到PACGp67A质粒上,获得OPCML-PACGp67A质粒后,通过脂质体介导,转染Sf9细胞,使其表达重组杆状病毒,经Western-blot检测表达产物。结果:OPCML-PACGp67A质粒转染Sf9细胞后,在相对分子质量约37 000处有一条新生蛋白带经检测为OPCML蛋白。结论:OPCML基因成功在Sf9细胞中得到表达。(本文来源于《广西医科大学学报》期刊2011年01期）
魏继福,张伟,赵凌,刘成成,马文静[10]（2009）在《杆状病毒昆虫细胞表达系统生产德国小蠊BgGSTD_1的研究》一文中研究指出目的蟑螂已经成为仅次于尘螨的第二大过敏源。目前有多种蟑螂过敏原被鉴定出来。BgGSTD1是德国小蠊中主要过敏原。目前已经被克隆并在大肠杆菌中进行了表达。但是还没有在昆虫杆状病毒系统表达的报道。方法从德国小蠊组织中提取总RNA,反转录产生cDNA,根据德国小蠊过敏原BgGSTD1(本文来源于《中华医学会2009年全国变态反应学术会议论文汇编》期刊2009-10-23）
昆虫细胞表达系统论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
HPV对于大多数女性而言,是一过性感染,大约80%的女性一生之中至少要感染一次HPV,在其引起细胞发生异常改变之前可以通过人体自身免疫力将它完全清除,不会对健康构成危害,也无法进行检测据研究结果表明,自从首次在宫颈癌组织中发现了HPV,则证实大约15种高危基因型HPV持续感染宫颈可以导致宫颈癌,癌前损害以及3级宫颈上皮内瘤病变(CIN3)、原位腺癌(AIS)。伴随着现代基因工程技术的飞速发展,已经建立了很多种异源蛋白的表达系统。昆虫细胞-杆状病毒表达系统自二十世纪八十年代问世,至今已不断改进完善,是重组蛋白表达技术的重要组成部分。与哺乳细胞的表达系统相比,昆虫细胞的表达量高,培养方式多样,且安全性好,具有广泛的应用。本文着重研究在昆虫细胞表达系统中,病毒的不同病毒感染复数(MOI)、不同的细胞感染密度(DOI)、不同细胞收获时间(TOH)对与HPV16L1的表达的影响。HPV16L1的构建表达:通过PCR合成16L1的基因,按照去除核定位信号设计PCR引物扩增截短型HPV16型目的基因,测序无误后重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒p Fast Bac TM1,将目的基因片段重组入Bacmid基因组,提取重组的Bacmid DNA,M13引物PCR鉴定正确,将重组的杆状病毒Bacmid-HPVL1用转染的方法转染sf9细胞大量感染昆虫细胞后获得P1,P1继续感染细胞获得P2,依次类推,获得大量P4代滴度稳定的毒种原液。在确定毒种能在昆虫细胞中稳定表达后,设计以下叁个优化表达的实验,⑴对病毒不同感染复数(MOI)的摸索:将细胞的接种密度(DOI)定在2.5×106个/ml,加毒后的第72小时收获,用不同的病毒感染复数(MOI)分别在昆虫细胞中表达后,收获细胞进行SDS电泳鉴定,确定最佳的病毒MOI;⑵对不同的细胞感染密度(DOI)的摸索:选取病毒感染复数(MOI)为0.5,加毒后的第72小时收获,用不同的细胞的感染密度(DOI)中接种毒种,在昆虫细胞中表达后,收获细胞进行SDS电泳鉴定,确定最佳细胞感染密度(DOI);⑶对不同收获时间(TOH)的摸索:选取病毒感染复数(MOI)为0.5,细胞的感染密度(DOI)定在2.5×106个/ml,接毒后按时间段分别取样收获后进行SDS电泳鉴定,确定最佳的收获时间。通过上述叁个优化实验后,确定HPV16L1在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中的最佳表达参数,在病毒感染复数(MOI)为0.5,细胞感染密度(DOI)在2.5×106个/ml,在感染细胞后72小时收获,HPV16L1在昆虫细胞中的表达量可达到150μg/ml,大量表达后进行超速离心纯化,通过免疫小鼠获得血清,应用假病毒中和抗体实验来检验免疫原性。本文通过对HPV生产工艺的初步研究,对未来生物制品在工业上的生产放大有一定指导意义。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
昆虫细胞表达系统论文参考文献
[1].陈鑫,胡玥玥,徐鸿毅,王晓燕,邓锴.重组人PLCζ蛋白在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化及活性测定[J].生物工程学报.2019
[2].白鹭.HPV16病毒样颗粒疫苗在昆虫细胞表达系统中的优化表达[D].吉林大学.2017
[3].李岭,王化磊,曹增国,金宏丽,郑学星.西尼罗病毒E蛋白在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中的表达及其鉴定[J].中国生物制品学杂志.2015
[4].卢慧,刁华,肖玉芳,于合国,李铮.昆虫细胞杆状病毒表达系统表达重组人类ZP3蛋白的研究[J].中华男科学杂志.2014
[5].李志红,Qiming,Jane,Wang.蛋白激酶D1催化结构域在昆虫细胞/杆状病毒表达系统内的表达、纯化和活性测定[J].生物工程学报.2014
[6].谭婷,刘芸,罗海华,李翠,姜勇.Tat-Vp3融合蛋白在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中的表达与纯化及其促凋亡功能的研究[J].感染、炎症、修复.2014
[7].万婧,相兴伟,江玲丽,周向阳.杆状病毒-昆虫细胞表达系统在复合体重组表达应用中的研究进展[J].生物技术通报.2014
[8].夏玉龙.应用昆虫细胞表达系统生产用于基因治疗的重组腺相关病毒的研究[D].浙江理工大学.2013
[9].覃宇翔,姚德生,高琨.OPCML基因在杆状病毒—昆虫细胞表达系统中的表达[J].广西医科大学学报.2011
[10].魏继福,张伟,赵凌,刘成成,马文静.杆状病毒昆虫细胞表达系统生产德国小蠊BgGSTD_1的研究[C].中华医学会2009年全国变态反应学术会议论文汇编.2009