剪切敏感型海洋灰绿曲霉极化生长基因的克隆及其缺失对发酵的影响

论文摘要

海洋丝状真菌灰绿曲霉HB1-19能产一种具有抗肿瘤活性的新型化合物灰绿霉素A,但是该菌株对剪切十分敏感,发酵放大难以实现,本研究旨在通过基因工程手段改造菌丝形态,以降低灰绿曲霉对剪切的敏感性。首先通过简并PCR和染色体步移的方法克隆得到灰绿曲霉极化生长相关的驱动蛋白AgKipA和地标蛋白AgTeaA、AgTeaR的基因序列,在此基础上通过构建双交换敲除质粒,以Sh ble作为筛选标记,分别对AgKipA和AgTeaR两个基因进行了敲除。缺失株在菌丝形态上发生了不同程度的弯曲,分生孢子萌发的方式也发生了相应的改变,但生长速度和发育没有受到影响。通过添加玻璃珠对缺失株的抗剪切能力进行了发酵水平的验证,发现菌丝形态弯曲并没有增强菌株的抗剪切能力。但是菌丝形态的弯曲却导致发酵液的颜色和发酵液中菌丝的结团状态发生了改变,同时使灰绿霉素A产生的时间发生了改变,△AgKipA的发酵周期与灰绿曲霉野生株相比缩短了24 h,而且灰绿霉素A产量没有受到影响,发酵周期的缩短有利于节约生产成本,提高经济效益。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 灰绿曲霉及灰绿霉素A简介
• 1.2 常见反应器类型
• 1.3 简并PCR技术
• 1.3.1 概述
• 1.3.2 简并引物的设计
• 1.3.3 简并PCR的反应条件
• 1.4 染色体步移方法简介
• 1.5 霉菌菌丝极化生长
• 1.5.1 概述
• 1.5.2 微管
• 1.5.3 马达蛋白
• 1.5.4 细胞末端标记蛋白或地标蛋白
• 1.6 本课题的研究背景及意义
• 第2章 极化生长基因AgKipA,AgTeaA和AgTeaR的克隆与序列分析
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 主要分子生物学试剂及试剂盒
• 2.2.3 培养基及培养条件
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 灰绿曲霉基因组提取
• 2.3.2 大肠杆菌Top10感受态细胞的制备及转化
• 2.3.3 简并引物设计及简并PCR
• 2.3.4 染色体步移
• 2.3.5 序列分析
• 2.3.6 灰绿曲霉RNA提取
• 2.3.7 除去RNA中的残留DNA
• 2.3.8 逆转录PCR
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 AgKipA,AgTeaA和AgTeaR基因的简并引物设计
• 2.4.2 简并PCR
• 2.4.3 AgKipA,AgTeaA和AgTeaR基因全长以及两端侧翼序列的获得
• 2.4.4 逆转录PCR鉴定AgKipA,AgTeaA和AgTeaR基因中内含子的位置
• 2.4.5 AgKipA,AgTeaA和AgTeaR序列分析
• 2.4.6 KipA,TeaA和TeaR系统进化树构建
• 2.5 小结
• 第3章 △AgKipA和△AgTeaR菌株的构建
• 3.1 前言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 主要分子生物学试剂及试剂盒
• 3.2.3 培养基及培养条件
• 3.3 实验方法
• 3.3.3 敲除质粒构建策略
• 3.3.4 引物设计及PCR反应
• 3.3.5 灰绿曲霉原生质体制备与转化
• 3.3.6 灰绿曲霉转化子筛选
• 3.3.7 孢子PCR
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 AgKipA和AgTeaR敲除质粒构建
• 3.4.2 AAgKipA和△AgTeaR菌株构建
• 3.5 小结
• 第4章 △AgKipA和△AgTeaR菌株表型分析及抗剪切效果鉴定
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 培养基及培养条件
• 4.2.2 菌丝生长速度考察
• 4.2.3 显微镜下的菌丝形态观察
• 4.2.4 分生孢子萌发方式考察
• 4.2.5 分生孢子及子囊果计数方法
• 4.2.6 抗剪切效果鉴定
• 4.2.7 灰绿霉素A测定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 缺失株与野生株生长速度比较
• 4.3.2 显微镜下的菌丝形态
• 4.3.3 分生孢子萌发
• 4.3.4 AgKipA和AgTeaR基因的缺失对灰绿曲霉发育的影响
• 4.3.5 △AgKipA,△AgTeaR和灰绿曲霉野生株发酵液颜色比较
• 4.3.6 △AgKipA,△AgTeaR和灰绿曲霉野生株灰绿霉素A产量过程曲线
• 4.3.7 △AgKipA和△AgTeaR的抗剪切效果鉴定
• 4.4 小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢