论文摘要
TNF阻断剂抑制树突状细胞吞噬自身造血前体细胞目的嗜血细胞综合症（Hemophagocytic Syndrome，HPS）是以单核细胞、吞噬细胞系增殖为特征的组织细胞增多症。近来的研究表明HPS中的吞噬细胞可能是树突状细胞，而且HPS患者肿瘤坏死因子（TNF-α）增加。在体外实验中，诱导CD34+造血干。前体细胞向红系分化过程中加入TNF-α则产生树突状细胞（DC），而树突状细胞吞噬红系前体细胞。本研究探讨在TNF-α诱导CD34+细胞过程中TNF阻断剂的作用。为探讨TNF阻断剂在HPS治疗中的作用奠定基础。材料和方法一、试剂牛血清白蛋白（BSA），Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium（IMDM）及propidium iodide（PI）购自Sigma公司（St Louis，MO，USA）。胎牛血清（FCS）购自Hyclone公司（Tokyo，Japan）。青霉素，链霉素购自Flow Laboratories Inc.（McLean，VA）。重组人EPO购自Chugai Pharmaceutical Co. （Tokyo，Japan）。重组人IL-3和SCF由kirin Brewery公司惠赠（Tokyo，Japan）。胰岛素（猪钠盐结晶，活性26.3u／mg美国药典）购自Wako Pure Chemical Industries（Osaka，Japan）。维生素B12购自Eisai公司（Tokyo，Japan）。叶酸购自日本武田药品工业株式会社（Osaka，Japan）。重组人TNF-α购自R&D公司（Minneapolis，MN）。Etanercept由日本武田药品工业株式会社惠赠（Tokyo，Japan）。Infliximab由日本田边制药株式会社惠赠（Kyoto，Japan）。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗血型糖蛋白A（GPA—FITC）购自Becton Dickinson公司（Franklin Lakes，NJ）。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD11c（CD11c-FITC）购自Dako公司（Kyoto，Japan）。藻红蛋白（PE）标记的CD11c（CD11c-PE）购自Beckman Coulter公司（Tokyo，Japan）。藻红蛋白（PE）标记的CD4（CD4-PE），CD123（CD123-PE）和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD4（CD4-FITC）购自BD Pharmingen公司（Tokyo，Japan）。二、人CD34+细胞的制备给正常健康志愿者注射重组人粒细胞刺激因子（G-CSF），动员CD34+细胞进入外周血，用CliniMACS细胞分离机分离并纯化CD34+细胞，置液氮中保存备用。三、纯化CD34+细胞的液体悬浮培养利用纯化CD34+细胞向红系诱导分化的方法。将冻结的纯化CD34+细胞于37℃水浴解冻，悬浮于IMDM（含20％FCS）中，然后在400g，4℃下高速离心5min，除去上清，用含有10％FCS的IMDM及含有0.3％BSA的IMDM洗细胞2次，再悬浮于0.3％BSA的IMDM中。细胞数为1×106／ml。将上述细胞悬浮于下列试剂的混合物中：20％FCS，10％热灭活库存人AB血清，1％BSA，胰岛素10μg／ml，维生素B120.5μg／ml，叶酸15μg／ml，β-ME 1.25×10-5mol／ml，IL-3 10ng／ml，SCF10ng／ml，EPO 2U／ml，青霉素50U／ml，链霉素50U／ml和IMDM。细胞浓度为2×104-4×104／ml。TNF阻断剂应用Etanercept和Infliximab。在37℃，5％CO2恒温箱中孵育规定的天数后收集细胞，用含0.3％BSA的IMDM洗细胞2次，计数细胞并测定细胞表面标记。四、细胞涂片标本的制作取培养后的细胞悬液少许经甩片机（cytospin）制成细胞标本，风干后行May-Giemsa染色。显微镜下观察细胞形态。五、流式细胞仪分析细胞由染色介质（含3％FCS和0.05％NaN3 PBS液）清洗2次，用FITC和PE标记的单克隆抗体进行双重染色，然后用FACS（荧光激活细胞分类器）Calibur（Beckton Dickinson）分析。六、统计学分析差异检验采用spss12.0软件进行t检验。结果一、1μg／ml Etanercept和2000μg／ml Infliximab基本能完全阻断100ng／ml TNF-α用于本研究的人CD34+细胞的纯度为98％，培养液中细胞浓度为4×104／ml，TNF-α浓度为100ng／ml，Etanercept浓度变化范围为0-10μg／ml，Infliximab浓度变化范围为0-2000μg／ml。在IL3、SCF、EPO存在下液体悬浮孵育7天，CD34+细胞分化为GPA+红系前体细胞。同时加入TNF-α后，则GPA+细胞受到了抑制，同时CD11c+细胞增加。Etanercept和Infliximab分别在1μg／ml和2000μg／ml时基本能完全抑制100ng／ml TNF-α，GPA+和CD11c+阳性率基本与阴性对照（IL3+SCF+EPO组）相同。二、Etanercept和Infliximab分别十分之一的浓度能阻断10ng／ml TNF-α0.1μg／ml Etanercept和200μg／ml Infliximab基本能抑制10ng／ml TNF-α，使GPA+细胞及CD11c+细胞水平基本与阴性对照（IL3+SCF+EPO组）相同。三、Etanercept和Infliximab添加的时间依赖性Etanercept和Infliximab对TNF-α的抑制效果随添加时间的延迟而递减，其中以与TNF-α同时添加效果最好。讨论关于细胞因子的研究结果显示HPS归因于细胞免疫失调。目前认为感染、炎症等诱导的细胞因子产生过剩是引起吞噬细胞异常活化的原因，其中包括IFN-γ，sIL-2R，TNF-α，IL-2，IL-6，IL-12和IL-18等。具体哪个细胞因子起关键作用还不明确，但TNF-α可能是启动因素。因此中和TNF-α很可能能够治疗HPS。Henzan等已报道了对各种治疗抵抗、难治性HPS对TNF阻断剂Infliximab治疗有效的一例病例。到目前为止，应用抗TNF-α疗法的报道还有2例，都是应用Etanercept，分别是Macrophage activation syndrome（MAS）和Langerehans’cell histiocytosis。另外最近也有在应用Etanercept后诱发Macrophage activation syndrome（MAS）的报道。结论在炎症早期中和TNF-α可能对治疗HPS有效。