异叶败酱草多糖抗宫颈癌作用及机理研究

论文摘要

宫颈癌是严重威胁女性健康的的恶性疾病,位居女性恶性肿瘤第二。目前使用化学合成药物治疗肿瘤的同时对机体产生毒害作用。因此,寻找安全有效的天然药物成为生物医药领域的一个研究热点。天然抗癌植物性多糖以其毒副作用小、生物活性强和不产生耐药性等优点引起了人们的高度重视。异叶败酱草作为我国传统的中草药,具有清热燥湿、止血、止带的功效,对治疗子宫糜烂、早期宫颈癌等效果显著。本研究旨在评估异叶败酱草多糖级分1 （PHB-P1）抗宫颈癌的作用效果,探讨其作用机制,为开发抗宫颈癌新药提供科学理论依据。试验一,异叶败酱草多糖的分离纯化和活性鉴定。本研究通过水提醇沉法提取了异叶败酱草粗多糖,并经过离子交换柱分离纯化得到分子量均一的异叶败酱草多糖级分1 （PHB-P1）,该多糖级分含有酮糖、葡萄糖糖醛酸等,提取率为1.57%。采用MTT法初步检测PHB-P1对人宫颈癌HeLa细胞和正常人外周血单核淋巴细胞的毒性作用,研究发现PHB-P1对HeLa细胞具有显著的毒性作用,其IC50为52.26μg/mL,而对正常的人外周血单核淋巴细胞没有明显的毒性作用。试验二,异叶败酱草多糖（PHB-P1）抗HeLa细胞增殖机制的研究。本研究作为体外试验以HeLa细胞为研究对象,PHB-P1（50μg/mL）处理HeLa细胞24 h和48 h,通过各种荧光染色法、原位末端标记技术（TUNEL）、DNA片段化分析、细胞周期分析、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）等技术,检测HeLa细胞的形态和生化特征的变化,以及细胞中caspase-3、明胶酶、端粒酶活性和相关基因表达的变化。研究结果表明PHB-P1（50μg/mL）能诱导HeLa细胞凋亡;能干扰HeLa细胞的细胞周期分布,使细胞在G0/G1期显著增加,伴随G2/M期细胞明显减少;能显著增强了HeLa细胞caspase-3的活性、显著抑制HeLa细胞分泌明胶酶、抑制HeLa细胞端粒酶的活性。而且,PHB-P1（50μg/mL）能够显著上调HeLa细胞中p53、Bax、p14ARF的mRNA表达量,显著下调Bcl-2的mRNA表达量。试验三,异叶败酱草多糖（PHB-P1）对荷瘤小鼠抗氧化力及免疫调节作用的影响。本研究以U14荷瘤小鼠为研究对象,生理盐水处理为阴性对照、环磷酰胺（CTX）为阳性对照药物,连续处理15 d,采用比色法等方法,从PHB-P1影响小鼠机体抗氧化能力和免疫调节方面分析了PHB-P1抗肿瘤的可能机制。研究发现PHB-P1高、低剂量（80、40 mg/kg b.w.）和CTX均能明显减缓肿瘤体积增大而抑制肿瘤生长,能有效地延长U14荷瘤小鼠的生命延长率,生命延长率分别为73.28%、40.46%和54.20%,对肝肾脏没有明显的毒害作用。PHB-P1高、低剂量能显著提高荷瘤小鼠血清中T-AOC活性（P<0.01, P<0.01）和显著降低MDA活性（P<0.05, P<0.05）,还能明显增强SOD活性（P<0.01, P<0.05）。而且,PHB-P1高剂量对肝组织SOD活性有显著的增强效果;PHB-P1高、低剂量均能明显提高荷瘤小鼠肝组织中T-AOC的水平,MDA水平显著减少。同时,PHB-P1高、低剂量处理均能提高荷瘤小鼠肾组织中T-AOC的水平,分别提高了79.65%和59.75%,但对肾组织中的MDA影响效果不明显,只有PHB-P1高剂量提高肾组织中SOD的水平（P<0.05）。PHB-P1高、低剂量（80、40 mg/kg b.w.）灌胃给药后,使荷瘤小鼠的胸腺指数从阴性组的0.79提高到1.37和1.22,脾脏指数而阴性组的11.71提高到13.58和11.88。CTX处理显著抑制小鼠胸腺指数。PHB-P1高、低剂量处理均可以显著提高荷瘤小鼠IFN-γ活性（P<0.01, P<0.05）,分别提高了41.22%和30.22%;高剂量PHB-P1能显著抑制TNF-α的活性（P<0.05）,低剂量PHB-P1的效果不明显;PHB-P1处理也能部分提高IL-2活性,但是效果不明显。试验四,异叶败酱草多糖（PHB-P1）抑制肿瘤生长作用机制的研究。本研究以U14荷瘤小鼠为研究对象,生理盐水处理为阴性对照、CTX为阳性对照药物,连续处理15 d,采用比色法、免疫组织化学技术、流式细胞术等方法,从PHB-P1影响小鼠肿瘤细胞周期和细胞凋亡方面综合分析了PHB-P1抗肿瘤的可能机制。研究结果表明异叶败酱草多糖PHB-P1高、低剂量（80、40mg/kg b.w.）和CTX处理可以有效地抑制U14实体瘤小鼠肿瘤的生长,肿瘤重量抑制率分别达42.68%、31.30%和54.06%,能诱导U14荷瘤小鼠肿瘤细胞发生凋亡,肿瘤细胞凋亡的百分率分别为20.96%、27.85%和31.03%。PHB-P1高、低剂量处理后小鼠血清乳酸脱氢酶（LDH）水平分别下降了23.94%和18.92% （P<0.01、P<0.01）,而PHB-P1高、低剂量处理均未能明显影响碱性磷酸酶（AKP）的水平。研究发现PHB-P1能干扰U14实体瘤小鼠肿瘤的细胞周期分布,使细胞在G0/G1期显著增加,伴随S期细胞明显减少;低剂量PHB-P1可以提高p19ARF蛋白的表达量,但是效果不明显,而高剂量PHB-P1能显著增强p19ARF蛋白的表达水平。而且PHB-P1能显著上调Bax蛋白的表达量,显著下调突变型p53和Bcl-2蛋白的表达量。本研究通过分离纯化得到异叶败酱草多糖PHB-P1,并通过体外培养的HeLa细胞和U14荷瘤小鼠模型试验,研究分析了PHB-P1抗宫颈癌的作用机制和调控途径,为PHB-P1作为天然抗癌药物的进一步研究和临床应用提供理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 宫颈癌的发病原因
• 1.1.1 病毒感染与宫颈癌
• 1.1.2 吸烟与宫颈癌
• 1.2 宫颈癌的检测技术
• 1.2.1 细胞形态学检测
• 1.2.2 HPV DNA 检测
• 1.2.3 HPV RNA 检测
• 1.2.4 杂交俘获技术
• 1.3 宫颈癌发生的分子机制
• 1.3.1 癌症的发生与细胞凋亡
• 1.3.2 宫颈癌与端粒酶
• 1.3.3 癌症的发生与细胞周期
• 1.4 癌症治疗现状
• 1.4.1 西医治疗
• 1.4.2 中医治疗
• 1.5 中药抗肿瘤机制
• 1.5.1 促进肿瘤细胞凋亡
• 1.5.2 增强机体免疫功能
• 1.5.3 诱导肿瘤细胞分化
• 1.5.4 减毒作用
• 1.5.5 抗氧化作用
• 1.6 细胞凋亡
• 1.6.1 细胞凋亡的形态学特征
• 1.6.2 细胞凋亡的生化变化
• 1.6.3 细胞凋亡的检测方法
• 1.6.4 Caspases 与细胞凋亡
• 1.7 败酱草属的抗肿瘤作用研究
• 1.7.1 败酱草化学成分
• 1.7.2 败酱草体内外抗癌作用
• 第二章 异叶败酱草多糖的分离纯化和活性鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 样品和细胞
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 异叶败酱草多糖的提取
• 2.2.2 中性糖含量测定
• 2.2.3 糖醛酸含量测定
• 2.2.4 蛋白质含量测定
• 2.2.5 塞氏（Seliwanoff）显色反应
• 2.2.6 莫氏（Molish）显色反应
• 2.2.7 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.8 异叶败酱草多糖级分对HeLa 细胞增殖的影响
• 2.2.9 异叶败酱草多糖级分对HPBMs 的细胞毒性作用
• 2.2.10 数据统计
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 异叶败酱草多糖提取率
• 2.3.2 异叶败酱草多糖级分总糖含量、糖醛酸、蛋白质含量
• 2.3.3 异叶败酱草多糖级分的定性分析
• 2.3.4 异叶败酱草多糖级分纯度的鉴定
• 2.3.5 异叶败酱草多糖级分对HeLa 的抗增殖作用
• 2.3.6 异叶败酱草多糖级分对HPBMs 的细胞毒性作用
• 2.4 讨论
• 2.4.1 多糖的提取
• 2.4.2 多糖的分离纯化
• 2.4.3 多糖的鉴定分析
• 2.4.4 异叶败酱草多糖的活性鉴定
• 2.5 小结
• 第三章 异叶败酱草多糖（PHB-P1）抗HeLa 细胞增殖机制的研究
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 样品和细胞
• 3.1.2 试剂
• 3.1.3 仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 细胞培养和收集
• 3.2.2 Hoechest 荧光单染
• 3.2.3 AO/EB 荧光双染
• 3.2.4 TUNEL 检测细胞凋亡
• 3.2.5 DNA 片段化分析
• 3.2.6 明胶-SDS-PAGE 电泳
• 3.2.7 比色法检测caspase-3 活性的变化
• 3.2.8 细胞周期分析
• 3.2.9 RT-PCR 检测肿瘤相关基因mRNA 表达情况
• 3.2.10 HeLa 细胞端粒酶活性检测
• 3.2.11 数据统计
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 Hoechest 33342 荧光单染形态变化
• 3.3.2 AO/EB 荧光双染形态变化
• 3.3.3 TUNEL 检测结果
• 3.3.4 DNA 片段化
• 3.3.5 明胶酶检测分析结果
• 3.3.6 PHB-P1 对caspase-3 活性的影响
• 3.3.7 PHB-P1 对细胞周期分布的影响
• 3.3.8 PHB-P1 对细胞相关凋亡基因表达的影响
• 3.3.9 PHB-P1 对HeLa 细胞端粒酶活性的影响
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PHB-P1 诱导HeLa 细胞凋亡
• 3.4.2 PHB-P1 对HeLa 细胞周期的影响
• 3.4.3 PHB-P1 诱导HeLa 细胞凋亡的基因调控
• 3.4.4 PHB-P1 对HeLa 细胞分泌明胶酶的影响
• 3.4.5 PHB-P1 对HeLa 细胞端粒酶的影响
• 3.5 小结
• 第四章 异叶败酱草多糖（PHB-P1）对荷瘤小鼠抗氧化力及免疫调节作用的影响
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 试验动物和细胞株
• 4.1.2 药品和试剂
• 4.1.3 仪器
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 小鼠急性毒性试验
• 4.2.2 U14 实体瘤模型的建立
• 4.2.3 PHB-P1 对小鼠治疗剂量的确定
• 4.2.4 试验分组和治疗方案
• 4.2.5 测定生命延长率和体积法测定肿瘤抑制率
• 4.2.6 荷瘤小鼠肝、肾脏病理切片观察
• 4.2.7 荷瘤小鼠血清抗氧化能力测定
• 4.2.8 荷瘤小鼠肝肾组织抗氧化能力测定
• 4.2.9 PHB-P1 处理对荷瘤小鼠免疫器官的影响
• 4.2.10 荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ含量测定
• 4.2.11 数据统计
• 4.3 试验结果
• 4.3.1 急性毒性试验
• 4.3.2 PHB-P1 抑制肿瘤生长和对生命延长率的影响
• 4.3.3 PHB-P1 对小鼠肝肾组织的影响
• 4.3.4 PHB-P1 对荷瘤小鼠血清抗氧化能力的影响
• 4.3.5 PHB-P1 对荷瘤小鼠肝肾组织抗氧化能力的影响
• 4.3.6 PHB-P1 处理对荷瘤小鼠免疫器官的影响
• 4.3.7 PHB-P1 对荷瘤小鼠血清TNF-α、IL-2、IFN-γ活性的影响
• 4.4 讨论
• 4.4.1 PHB-P1 对荷瘤小鼠抗氧化力的影响
• 4.4.2 PHB-P1 对荷瘤小鼠免疫功能的影响
• 4.4.3 PHB-P1 对荷瘤小鼠生命延长率的影响
• 4.5 小结
• 第五章 异叶败酱草多糖（PHB-P1）抑制肿瘤生长作用机制的研究
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 试验动物和细胞株
• 5.1.2 药品和试剂
• 5.1.3 仪器
• 5.2 试验方法
• 5.2.1 U14 实体瘤模型的建立
• 5.2.2 试验分组和治疗方案
• 5.2.3 重量法测定肿瘤抑制率
• 5.2.4 荷瘤小鼠肿瘤病理切片观察
• 5.2.5 肿瘤组织TUNEL 检测
• 5.2.6 荷瘤小鼠血清LDH 和AKP 水平测定
• 5.2.7 肿瘤细胞周期分析
• ARF 蛋白表达的检测'>5.2.8 肿瘤组织p53、Bcl-2、Bax 和p19^ARF蛋白表达的检测
• 5.2.9 数据统计
• 5.3 试验结果
• 5.3.1 PHB-P1 对荷瘤小鼠体重和肿瘤生长的影响
• 5.3.2 荷瘤小鼠肿瘤组织的病理学观察
• 5.3.3 PHB-P1 对肿瘤凋亡细胞数量的影响
• 5.3.4 PHB-P1 对荷瘤小鼠血清LDH 和AKP 的影响
• 5.3.5 PHB-P1 处理对肿瘤细胞周期的影响
• ARF 蛋白表达的影响'>5.3.6 PHB-P1 处理对肿瘤组织p53、Bcl-2、Bax 和p19^ARF蛋白表达的影响
• 5.4 讨论
• 5.4.1 PHB-P1 诱导荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡
• 5.4.2 PHB-P1 对U14 实体瘤小鼠血清LDH 和AKP 的影响
• 5.4.3 PHB-P1 干扰荷瘤小鼠肿瘤细胞周期
• 5.4.4 PHB-P1 处理对荷瘤小鼠肿瘤组织凋亡相关蛋白的影响
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介