深海热液口硫化物及沉积物微生物多样性及其与环境相互关系研究

论文摘要

热液口生态系统自从1977年发现以来,被誉为“生命绿洲”。热液口生态系统的发现使人们对“生物圈”的认识有了进一步的了解。热液喷发物含有大量的化学物质和能量,由此孵育了耐高温、高压和分解有毒气体并且不依靠太阳能生活的大量生物。这个生态系统的环境特征被认为与地球生命形成早期的环境特征相似,因此研究热液生命系统中的嗜压、嗜热等极端微生物无疑具有重大的意义。古菌的氨氧化作用是在2005年以来发展的新课题。一直以来,科学家认为β-和γ-类型的细菌在氨氧化作用中占主导地位,古菌并不具备氨氧化的功能。但在2005年科学家通过基因组的研究发现古菌16S rRNA与类似细菌amoA的基因并排排列。同年分离得到了以氨为唯一能量来源的中温泉古菌,使得古菌能够进行氨氧化这一理论得到证实。随之而来的问题是,在其他生态系统中,是否也存在古菌的氨氧化作用?其多样性如何?不同生态系统古菌与细菌的氨氧化作用如何?哪些类型的古菌具有氧化氨的功能?本论文以2005年Atlantic/Alvin科学考察船中美联合取样得到的硫化物和同年中国“大洋一号”科学考察船取得的热液区沉积物样品为实验材料,对3个硫化物和15个沉积物样品进行氨氧化古菌的多样性及定量分析,并对2个硫化物和墨西哥湾沉积柱的甲烷菌进行多样性调查。对硫化物氨氧化古菌的多样性分析表明热液口硫化物的氨氧化古菌多样性并不丰富,但是序列比较特异。温度较低的样品的多样性比较丰富,温度较高的样品的多样性较低。所有3个样品的克隆子分成两个类型,定义为Chimney Group I和Chimney Group II。两个类型间序列具有明显的区别,平均相似性为80%。其中Chimney Group I与日本海的沉积物有较高的同源性（94%）,而Chimney Group II与NCBI基因库的克隆子最高同源性也仅为89%。说明这个类型的克隆子序列比较新,有可能是存在于热液口硫化物中的特异氨氧化古菌。对硫化物的一个样品进行古菌16S rRNA的多样性分析表明氨氧化古菌并不属于MG1。16S rRNA来自嗜热泉古菌Desulfurooccales、Thermoproteales和Thermococcales。定量分析也表明氨氧化古菌amoA基因与古菌16S rRNA基因的拷贝数比例为6:94,这样的一个比例应该是比较容易的检测到,所以有可能这个样品中的氨氧化古菌与MG1并无关系。对热液口沉积物的古菌amoA基因及古菌16S rRNA的多样性分析表明,古菌amoA序列与深海来源的克隆子序列有比较高的同源性,表明热液口沉积物与深海沉积物的氨氧化古菌有相似起源。同样对16S rRNA多样性的分析表明,热液口沉积物的克隆子全部属于MG1,因此热液口沉积物的氨氧化古菌可能来自MG1这个广泛存在的类型。在热液口沉积物与西太平洋暖池区沉积物的比较中,两者有比较大区别,两者的OTUs类型完全独立,不互相包含。此外暖池区沉积物中部分克隆子来自Marine Bethic Group。说明热液口沉积物与其它沉积物的氨氧化古菌还是有比较大区别。通过Real-Time PCR定量分析所有沉积物样品（16个）中的古菌16S rRNA、AOA-amoA和AOB-amoA。结果表明古菌amoA基因在沉积物中的含量丰富,且与细菌amoA的含量相似或更高,表明在热液口沉积物中古菌氨氧化比细菌氨氧化的作用更重要。在热液口沉积物中的氨氧化古菌16S r RNA基因数量从4.598×104拷贝/克（干重）～7.027×107拷贝/克（干重）,古菌amoA基因数量从4.597×104拷贝/克（干重）～6.701×106拷贝/克（干重）,细菌amoA基因的数量从1.182×104拷贝/克（干重）～2.302×106拷贝/克（干重）,氨氧化古菌与氨氧化细菌的数量比值在0.75～170之间。相关性分析表明古菌16S rRAN与古菌amoA基因存在相关性（r=0.652,n=16,P﹤0.01）,古菌amoA拷贝数与有机物含量（包括有机氮、有机碳、有机质）、无机氮、总氮、及NH4+、NO3-、NO2-和硝化潜势、pH值有显著（P﹤0.01）或相关（P﹤0.05）关系,细菌amoA拷贝数与有机质含量、无机氮、总氮、及NH4+、NO3-、NO2-和硝化潜势、pH值有显著相关（P﹤0.01）或相关（P﹤0.05）关系。古菌amoA基因数量与细菌amoA基因数量间也存在显著相关（P﹤0.01,12个位点）或相关（P﹤0.05,4个位点）关系。此外本论文利用甲烷菌辅酶M的编码基因mcrA对热液口硫化物及墨西哥湾沉积物的甲烷菌群进行多样性调查,结果发现在这两个甲烷含量丰富的地区甲烷菌类型完全不同。在热液喷发成因的热液口地区,甲烷产生菌占主导地位;在热成因墨西哥湾地区,甲烷氧化菌占主导地位。本论文回答了前文提出的氨氧化古菌在洋脊热液区生态系统中的生态多样性及生态作用问题,无疑对古菌氨氧化作用的研究更进了一步,也必将推动古菌氨氧化作用的更深入的研究。同时本文以热液口样品为研究对象,对揭示热液口生态系统起到了一定的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 洋脊概况
• 1.2 洋脊的地球化学性质研究
• 1.3 热液口周围生态环境微生物研究
• 1.4 热液微生物在物质循环中的作用
• 1.5 微生物分子生态学研究的主要方法
• 1.5 分子进化的研究方法
• 1.6 系统进化树的构建方法
• 1.7 系统进化树构建常用软件
• 1.8 系统进化树构建方法及软件的选择
• 1.9 研究目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料与所用设备
• 2.2 试验基本方法
• 3 结果与分析
• 3.1 胡安得富卡热液场硫化物矿物组成分析
• 3.1.1 4148 烟囱矿物分析
• 3.1.2 4136-1 硫化物矿物分析
• 3.1.3 4143-1 硫化物矿物分析
• 3.2 胡安得富卡热液场中氨氧化古菌的多样性及其定量研究
• 3.2.1 胡安得富卡热液场硫化物岩石中氨氧化古菌定量
• 3.2.2 胡安得富卡热液场硫化物岩石中氨氧化古菌多样性分析
• 3.2.3 胡安得富卡热液场硫化物4136-1 古菌多样性分析
• 3.3 洋脊热液区沉积物氨氧化古菌多样性及其定量研究
• 3.3.1 洋脊热液地区15 个沉积物和西太平洋1 个沉积物的化学参数测定结果
• 3.3.2 洋脊热液地区15 个沉积物和西太平洋1 个沉积物的165 rRNA、古菌和细菌amoA 的定量结果与分析
• 3.3.3 基因定量结果与化学数据及硝化潜势的相关和回归关系分析
• 3.3.4 洋脊热液区沉积物氨氧化古菌amoA 多样性分析
• 3.3.5 洋脊热液区沉积物古菌165 rRNA 多样性分析
• 3.4 胡安得富卡热液场甲烷菌多样性研究及其与环境的关系
• 3.4.1 甲烷菌甲基辅酶M 编码基因mcrA 的文库构建及测序
• 3.4.2 甲烷菌甲基辅酶M 编码基因mcrA 序列分析及多样性评估
• 3.4.3 甲烷菌甲基辅酶M 编码基因mcrA 系统进化分析
• 3.4.4 热液口金属硫化物甲烷菌类型分析
• 3.4.5 金属硫化物岩石中甲烷菌类型与环境的关系
• 3.5 墨西哥湾甲烷菌多样性研究及其与环境的关系
• 3.5.1 墨西哥湾沉积物mcrA 基因的文库构建、RFLP 分析与测序
• 3.5.2 墨西哥湾沉积物mcrA 基因序列分析及多样性评估
• 3.5.3 墨西哥湾沉积物甲烷菌mcrA 基因同源比对结果与分析
• 3.5.4 墨西哥湾沉积物甲烷菌mcrA 基因系统进化分析
• 3.5.5 墨西哥湾沉积物不同层次甲烷菌类型比较
• 3.5.6 墨西哥湾沉积物甲烷菌类型分析
• 4. 讨论
• 4.1 海洋中古菌与细菌在氨氧化过程中的作用
• 4.2 海洋中的甲烷产生与厌氧甲烷氧化作用
• 4.3 微生物分子生态研究的定量研究方法
• 5 总结
• 参考文献
• 附录1 缩写词表（Abbreviations）
• 附录2 载体pMD-18T 图谱:
• 附录3 主要采样设备
• 致谢
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果