毛果杨MYB-like1转录因子调控花青素合成代谢的研究

论文摘要

花青素是在植物的生长和发育过程中发挥重要作用的一类次生代谢产物,它的生物合成主要受到两类基因的控制：一类是结构基因,另一类是调控基因即转录因子。本研究从毛果杨茎段中克隆出一个转录因子,通过对其结构域进行分析发现它包含一个非典型的MYB结构域,将其命名为PtMYB-like1。为研究该转录因子的功能,运用分子生物学和遗传学的手段将其转入到模式植物拟南芥中,发现该转录因子卷入到花青素合成途径的调控,具体结果如下：通过半定量PCR分析毛果杨不同组织处的表达特性显示,PtMYB-like1基因在毛果杨的成熟叶、老叶、老茎、木质部中表达量比较高,在顶芽、幼茎、韧皮部表达比较微弱,在根部无表达。通过遗传学手段分析,与野生型（WT）植株相比,转基因植株出现了株叶片和叶柄处发紫的表型,暗示PtMYB-like1基因可能参与调控花青素合成代谢；通过生理含量分析,过表达植株TP5、TP12、TP13花青素含量分别是野生型的8倍、7倍和6倍,这一结果证实了PtMYB-like1参与了花青素的合成代谢。运用定量PCR对转基因植株花青素合成途径上的结构基因和调控基因进行分析,结果表明：在转基因株系中,大部分结构基因的表达水平较野生型均有不同程度的升高,其中,PAL、C4H、4CL、DFR、ANS、FLS3、78D2、GST1、TT19等结构基因的表达水平是WT植株的5-10倍,CHS、F3H、F3’H、FLS1、75C1、FGT、BAN、TL2等基因的表达量是野生型的20多倍,尤其是在表达量最高的TP5植株中最为明显。在调控基因中,TT2、PAP1、TT8、MYB111、MYB113、MYB11基因的转录水平均有了明显的提高,特别是在TP5植株中,PAP1基因的转录水平是野生型的45倍,MYB11、MYB113基因的转录水平是野生型的25倍；而PAP2、TT8、TTG1、MYB111、EGL3基因的转录水平虽然没有PAP1明显,但是也在不同的程度上有所提高。这一结果清楚的显示了PtMYB-like1转录因子调控花青素合成途径上结构基因和调控基因的转录水平,增强了花青素的合成代谢。我们的研究鉴定了一个参与花青素合成途径调控的MYB家族转录因子,为深入了解毛果杨MYB家族的转录因子提供了研究材料,同时也为观赏植物新品种培育提供一个非常有价值的基因资源。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 花青素的功能
• 1.3 植物花青素的生物合成途径
• 1.4 转录因子对花青素合成途径的调控
• 1.4.1 转录因子
• 1.4.2 MYB转录因子调控花青素的合成
• 1.4.3 BHLH和其他家族转录因子调控花青素的合成
• 1.4.4 MWB复合物在花青素合成途径上的作用
• 1.5 影响花青素合成的其他因素
• 1.5.1 温度对花青素合成的影响
• 1.5.2 光照对花青素合成的影响
• 1.5.3 蔗糖对花青素合成的影响
• 1.6 花青素在园林植物应用上的研究进展
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 PtMYB-like1基因的特性分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 PCR反应的引物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PtMYB-like1基因预测
• 2.2.2 DNA序列一致性比对
• 2.2.3 进化树的构建
• 2.2.4 毛果杨的组织培养
• 2.2.5 毛果杨RNA提取方法
• 2.2.6 RNA浓度测定及电泳
• 2.2.7 总cDNA的合成
• 2.2.8 PCR扩增片段及回收
• 2.2.9 目的片段连接载体及转化
• 2.2.10 半定量RT-PCR
• 2.3 结果分析
• fgenesh4_pg.C_LG_X0649基因的克隆'>2.3.1 estExt_fgenesh4_pg.C_LG_X0649基因的克隆
• fgenesh4_pg.C_LG_X0649基因的序列分析'>2.3.2 estExt_fgenesh4_pg.C_LG_X0649基因的序列分析
• 2.3.3 PtMYB-like1基因系统进化树的构建
• 2.3.4 PtMYB-like1基因的组织表达特性
• 2.4 讨论
• 3 PtMYB-like1基因在拟南芥中的转化研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和质粒
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总RNA的提取
• 3.2.2 质粒的提取
• 3.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 3.2.4 构建植物表达载体
• 3.2.5 植物表达载体的转化
• 3.2.6 农杆菌感受态的制备
• 3.2.7 农杆菌转化拟南芥
• 3.2.8 转基因苗的筛选
• 3.2.9 转基因苗的鉴定
• 3.2.10 拟南芥基因组DNA的提取
• 3.2.11 花青素含量的测定
• 3.2.12 荧光定量表达分析
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 转PtMYB-like1基因拟南芥基因组DNA鉴定
• 3.3.2 转基因植株PtMYB-like1转录水平分析
• 3.3.3 转PtMYB-like1基因植株的表型分析
• 3.3.4 PtMYB-like1基因增强植株花青素的合成代谢
• 3.3.5 PtMYB-like1基因正调控拟南芥花青素合成途径结构基因表达
• 3.3.6 PtMYB-like1基因正调控拟南芥花青素合成途径调控基因的表达
• 3.4 讨论
• 3.4.1 PtMYB-like1基因增强了花青素合成代谢
• 3.4.2 PtMYB-like1基因增强了木质素的合成代谢
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢