分枝杆菌热休克蛋白65受体的实验研究

论文摘要

分枝杆菌热休克蛋白65（mycobacterial heat shock protein 65,HSP65）是热休克蛋白家族的一个成员,它能够协助外源蛋白进入抗原递呈细胞并经MHC-I 类途径递呈,进而激活外源蛋白特异性的细胞毒性T 淋巴细胞（CTL）。研究表明,CD91 是HSP gp96 在细胞表面的受体,介导gp96多肽复合物被细胞内吞,但是HSP65 的受体至今尚未见报道。为了研究在不同细胞,尤其是抗原递呈细胞表面上是否存在HSP65的受体,我们表达并纯化了HSP65 绿色荧光蛋白融合蛋白（HSP65-GFP）和HSP65。采用HSP65-GFP 和HSP65 做细胞的结合实验和竞争实验,发现小鼠腹腔巨噬细胞和人外周血单个核细胞的贴壁细胞能和HSP65-GFP结合,说明在小鼠腹腔巨噬细胞和人外周血单个核细胞的贴壁细胞表面可能存在HSP65 的受体。本工作为进一步探寻HSP65 的作用机理提供了基础。

论文目录

• 引言
• 1 HSP 概述
• 2 HSP 与多肽的结合及复合物的免疫原性
• 3 HSP 与天然免疫
• 4 HSP 受体
• 4.1 CD91
• 4.2 CD40
• 4.3 CD36
• 4.4 LOX-1
• 4.5 TLR
• 4.6 SR-A
• 5 HSP 的信号转导
• 材料和方法
• 1 实验材料
• 1.1 限制性内切酶及其它试剂
• 1.2 质粒和菌种
• 1.3 实验标本
• 1.4 引物合成
• 1.5 培养基及缓冲液
• 1.6 SDS-PAGE 和Western Blot 所用试剂
• 1.7 纯化蛋白所用试剂
• 2 实验方法
• 2.1 PCR 法获取GFP 片断
• 2.2 PCR 产物电泳及回收
• 2.3 PCR 产物与pMD18-T 载体连接
• 2.4 感受态细胞制备
• 2.5 连接产物转化到JM109 感受态细胞
• 2.6 质粒的提取与鉴定
• 2.7 将GFP 从pMD18-T 载体上亚克隆到pET28-HSP65 上
• 2.8 重组蛋白HSP65-GFP 在大肠杆菌中诱导表达
• 2.9 SDS-PAGE
• 2.10 Western Blot
• 2.11 镍亲和层析法纯化重组蛋白HSP65-GFP 和HSP65
• 2.12 细胞的准备
• 2.13 结合实验
• 2.14 竞争实验
• 实验结果
• 1 重组PET28-HSP65-GFP 质粒的构建及序列测定
• 1.1 PCR 法钓取GFP 基因
• 1.2 GFP 基因的TA 克隆和测序
• 1.3 重组pET28-HSP65-GFP 质粒的构建和测序
• 2 重组 HSP65、HSP65-GFP 蛋白的表达、纯化和鉴定
• 2.1 重组HSP65-GFP 蛋白的诱导表达、纯化和鉴定
• 2.2 重组HSP65 蛋白的诱导表达、纯化和鉴定
• 3 HSP65-GFP 与小鼠腹腔巨噬细胞的结合实验
• 3.1 时间和温度对结合实验的影响
• 3.2 胎牛血清对结合实验的影响
• 3.3 HSP65 对HSP65-GFP 与巨噬细胞结合的竞争实验
• 4 HSP65-GFP 与人外周血单个核细胞的结合实验
• 5 HSP65-GFP 与U937 细胞的结合实验
• 6 HSP65-GFP 与血小板的结合实验
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 图片
• 英文缩写词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介