坛紫菜对高温胁迫应答机制的初步研究

论文摘要

本研究以耐高温型坛紫菜Z-61F4、Z-26F4纯系叶状体作为实验材料，以野生型坛紫菜叶状体作为对照，分别从生长发育特征、生理生化指标以及基因差异表达等方面对坛紫菜叶状体在高温胁迫下的响应机制进行了初步研究。结果表明：1、生长发育特征方面：两个耐高温型坛紫菜品系叶状体经高温（30℃、26℃）胁迫10d后，藻体颜色分别由正常温度（21℃）时的红褐色与褐红色逐渐变浅，但将其转入正常温度下培养能够基本恢复正常生长，而野生型坛紫菜叶状体经30℃高温胁迫2d后即出现细胞质外溢、逐渐坏死的现象，转至正常温度下培养不能恢复正常生长；2、在品质指标方面：本研究测定了2个耐高温型F4与1个野生型坛紫菜叶状体在30℃、26℃、21℃三个温度下分别处理0d、2d、4d、6d、8d、10d后的5个品质指标（藻胆蛋白、叶绿素a、粗蛋白、总氨基酸及游离氨基酸），3个品系在21℃下培养10d后各指标变化不显著（P>0.05），30℃、26℃下多数指标动态变化，胁迫10d后呈现显著或极显著降低（P<0.05或P<0.01），耐高温型品系降低幅度较野生型小；3、在生理生化指标方面：测定了2个耐高温型与1个野生型坛紫菜叶状体在30℃、26℃、21℃三个温度下分别处理0d、2d、4d、6d、8d、10d后的7个生理生化指标[自由基含量、过氧化氢（H2O2）含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性及游离脯氨酸（Pro）含量]，根据各指标在胁迫周期内的动态变化，推测耐高温型坛紫菜叶状体应答高温胁迫的生理生化过程为：高温胁迫→活性氧含量上升→细胞膜氧化受损，产生大量膜脂过氧化物→细胞感受到过量的活性氧信号→抗氧化系统和渗透压调节系统共同响应，清除活性氧→自由基含量下降；同时比较了两种坛紫菜对高温胁迫的生理生化响应过程，发现耐高温型坛紫菜在高温胁迫下能同时启动抗氧化系统和渗透压调节系统，而野生型坛紫菜则只能启动渗透压调节系统，且两种坛紫菜抗氧化系统的本底含量也存在着显著差异（P<0.05）；4、利用引物退火控制技术（ACP），对耐高温型坛紫菜Z-61F4叶状体胁迫6d后与正常温度培养下的cDNA进行扩增筛选得到多个基因差异表达片段，并对其中6个（GW-1、GW-2、GW-3、GW-4、GW-5、GW-6）片段进行测序分析，片段大小分别为387bp、512bp、702bp、360bp、228bp与132bp，同源性比对发现这些基因与信号转导、蛋白代谢等相关。对前5条基因进行实时荧光定量PCR分析显示，在0d与6d间的表达量均存在显著或极显著差异（P<0.05或P<0.01）。其中GW-3为全长基因，编码核糖体蛋白S7，GenBank数据库登录号JF719273。预测该基因编码195个氨基酸，理论等电点为9.99，不稳定系数为37.43，脂肪系数为88.00。残基构成螺旋（H）、片层（E）和环状（L）占总氨基酸比例分别为38.46%、21.54%与40.00%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 引言
• 1.1 植物应答高温胁迫研究概述
• 1.1.1 高温胁迫对植物生长发育的影响
• 1.1.2 植物对高温胁迫的生理响应
• 1.1.3 植物对高温胁迫的生化响应
• 1.1.4 植物对高温胁迫的分子响应
• 1.2 紫菜应答逆境胁迫研究概述
• 1.2.1 藻类应答逆境胁迫研究概述
• 1.2.2 紫菜应答逆境胁迫的生理生化机制
• 1.2.3 紫菜应答逆境胁迫的分子机制
• 1.3 基因差异表达研究技术
• 1.3.1 抑制差减杂交技术
• 1.3.2 DNA 微阵列技术
• 1.3.3 基因表达系列分析技术
• 1.3.4 引物退火控制（Annealling Control Primer，ACP）技术
• 1.4 本研究的目的意义
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验仪器
• 2.3 主要实验试剂
• 2.3.1 坛紫菜培养母液
• 2.3.2 色素提取试剂
• 2.3.3 粗蛋白含量测定主要试剂
• 2.3.4 氨基酸含量测定主要试剂
• 2.3.5 坛紫菜叶状体生理指标测定主要试剂
• 2.3.6 坛紫菜应答高温胁迫基因差异表达分析主要试剂
• 2.4 实验方法
• 2.4.1 材料培养
• 2.4.2 高温胁迫条件下坛紫菜藻体的显微观察
• 2.4.3 高温胁迫条件下坛紫菜叶状体的品质指标测定
• 2.4.4 高温胁迫条件下坛紫菜叶状体生理指标的测定
• 2.4.5 高温胁迫条件下坛紫菜差异表达基因片段的克隆及定量分析
• 第3章 结果
• 3.1 坛紫菜各实验品系藻体特征
• 3.2 高温胁迫条件下对坛紫菜藻体的显微观察
• 4叶状体'>3.2.1 Z-61 F₄叶状体
• 4叶状体'>3.2.2 Z-26 F₄叶状体
• 3.2.3 野生型坛紫菜叶状体
• 3.3 高温胁迫条件下坛紫菜叶状体品质指标的变化
• 4叶状体'>3.3.1 Z-61 F₄叶状体
• 4叶状体'>3.3.2 Z-26 F₄叶状体
• 3.3.3 野生型坛紫菜叶状体
• 3.4 高温胁迫条件下坛紫菜叶状体生理指标的变化
• 4叶状体与野生型坛紫菜的比较'>3.4.1 坛紫菜 Z-61 F₄叶状体与野生型坛紫菜的比较
• 4叶状体与野生型坛紫菜的比较'>3.4.2 坛紫菜 Z-26 F₄叶状体与野生型坛紫菜的比较
• 4叶状体与 Z-26 F₄叶状体比较'>3.4.3 坛紫菜 Z-61 F₄叶状体与 Z-26 F₄叶状体比较
• 3.5 高温胁迫条件下坛紫菜基因差异表达片段的克隆及定量比较
• 3.5.1 坛紫菜叶状体总 RNA 的提取
• 3.5.2 基因差异表达片段的筛选及序列分析
• 3.5.3 全长序列蛋白质结构分析及预测
• 3.5.4 基因差异表达片段的实时荧光定量 PCR 分析
• 第4章 讨论
• 4.1 耐高温型坛紫菜在不同温度下的生理响应
• 4.2 耐高温型坛紫菜在不同温度下的生化响应
• 4.3 不同坛紫菜品系耐高温性状比较
• 4.3.1 高温胁迫下各品系生长差异分析
• 4.3.2 高温胁迫下各品系生理指标差异分析
• 4.3.3 高温胁迫下各品系品质性状差异分析
• 4.4 基因差异表达片段在高温胁迫不同时间水平下的表达情况
• 4.5 全长序列的分析
• 结论与展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 在学期间发表的学术论文