论文摘要
HBV感染是全球性健康问题,我国更是一个HBV高感染地区。HBV属嗜肝DNA病毒科,基因组长约3.2kb,为部分双链环状DNA,分为A～H 8个基因型,各基因型又可分为不同基因亚型。各基因型具有不同的地理分布,亚洲感染者主要感染的是基因型B和C。HBV前S/S（pre-S/S）区编码大、中、小3种表面蛋白。尽管HBV是DNA病毒,但它特有的一些特征使它的突变几率远远比别的DNA病毒高。在HBV感染者体内,突变株往往与野生型病毒一起成为混合病毒群。HBV的基因变异对分子生物学和免疫学分析的敏感性提出了挑战。pre-S/S基因突变给乙型肝炎的实验诊断、治疗及判断预后带来许多临床问题。诊断HBV感染的免疫学试验是检测一系列HBV免疫学标志物。病毒基因的变异所致的一系列病毒表型的改变,使人们对免疫学诊断提出质疑。在我们日常的实验诊断工作中经常会遇到异常的HBV血清学诊断模式,包括:HBsAg和HBsAb同时存在,乙肝五项中仅HBcAb强阳性,乙肝五项中仅HBeAb强阳性,HBsAg阴性但HBeAg阳性,不同诊断试剂诊断HBsAg结果不一致。这些血清学诊断模式的异常可能与HBV pre-S/S基因突变有关。常用的血清学诊断方法在遇到影响抗原决定簇构象、抗原不表达或分泌缺陷等基因突变时,会出现检测失败。pre-S/S基因变异可导致免疫逃避、隐匿性HBV感染,血清学检测时表现为HBsAg和HBsAb同时存在或HBsAg阴性。许多年来,人们都以病人血清中HBsAg作为HBV感染的特征,HBVpre-S/S基因突变对HBsAg检测和其他HBV血清学标记物的影响及其相关性需要进一步研究。HBVpre-S突变和“a”决定簇内部的突变对于免疫逃避和隐匿性感染的影响在不同国家和地区的研究结论并不相同。通常认为“a”决定簇内部的突变,尤其是G145R突变是免疫逃避的主要突变位点。有关东亚地区的HBVpreS/S突变数据采集主要来自于日本、中国台湾地区、韩国,这提示在中国pre-S和S区基因突变研究数据不多,本地区（即中国大陆）preS/S突变发生位点及preS/S突变与HBV血清学异常检测模式的关系尚需研究。本研究旨在通过对各种异常HBV血清学检测模式的标本进行S基因分型和pre-S/S区突变分析,提供本地区HBV基因型和突变株流行病学数据,探讨pre-S/S基因突变与各种异常血清学诊断模式的关系,分析pre-S/S基因突变对实验诊断结果的影响和造成免疫逃避和隐匿性HBV感染的各种因素。本研究收集了临床五种异常HBV血清学检测结果的标本,并以具有常见血清学检测结果的标本作为对照组。采用DNA定量检测方法筛选HBVDNA阳性的标本。应用病毒核酸提取效率较高的方法提取收集血清的HBVDNA。设计特异性引物,通过PCR扩增得到各模板中HBVpre-S/S扩增产物,并对扩增产物进行纯化。通过PCR产物直接测序或克隆测序的方法得到各标本中HBVpre-S/S基因序列,进而进行S基因分型和pre-S/S区缺失突变和点突变分析。采用非参数假设检验方法—Wilcox rank sum test进行统计学分析,讨论pre-S/S区突变与各种异常血清学检测模式的关系。根据血清学实验结果和核酸检测结果,实验标本可被分为三部分进行分析。第一部分为HBsAg和HBsAb检测同时阳性的标本。测序分析发现这些标本中存在pre-S缺失突变、pre-S2起始密码子突变和“a”决定簇中少数位点的点突变,其中2例标本出现G145R/A突变。与对照组（HBsAg阳性而HBsAb阴性的标本）比较发现pre-S缺失突变与HBsAg和HBsAb同时存在具有一定统计学相关性（P=0.024）,而pre-S2起始密码子突变和“a”决定簇点突变与这种检测模式不具有统计学相关性（P=0.571,P=0.408）。pre-S缺失突变主要发生在pre-S1 3’端和pre-S2 5’端,3例标本中pre-S1 3’端大片段缺失突变株与野生型共同存在。pre-S缺失突变通过影响HBV多个功能位点从而形成体内的免疫逃避,造成HBsAg和HBsAb检测同时阳性。第二部分为HBsAg阴性但HBVDNA阳性的标本,其中包括HBsAg阴性但HBeAg阳性的检测模式、乙肝五项中仅HBcAb强阳性或仅HBeAb强阳性的检测模式。仅HBcAb强阳性或仅HBeAb强阳性的检测模式中发现HBV隐匿性感染的存在,比率分别为1.6%和3.3%。测序结果统计学分析发现pre-S缺失突变、pre-S2起始密码子突变和“a”决定簇中的点突变与HBsAg血清学检测失败均有统计学相关性（P=0.033,P=0.033,P=0.033）。“a”决定簇的点突变中2例标本出现G145R/A突变。突变株存在多重突变和混合感染,但结果分析发现造成HBsAg漏检的原因不仅仅是pre-S/S突变,循环中HBsAg水平低于检测限也是另外一个重要的漏检原因。第三部分为不同诊断试剂诊断HBsAg结果不一致的标本。核酸检测均为阴性,未发现pre-S/S基因突变。这一部分标本核酸检测的阴性结果可能与标本选择的局限性有关。本研究结果表明由于HBV在体内长期存在和免疫压力下,慢性HBV感染者可以通过pre-S/S基因突变导致免疫逃避,形成HBsAg和HBsAb同时阳性的检测结果,pre-S缺失突变与这种检测模式具有相关性。文献报道“a”决定簇点突变与这种模式具有相关性,而在本研究中并未得到相同结论。临床免疫检测中HBsAg漏检的原因可能是由于pre-S/S基因突变引起抗原决定簇构象变化或影响抗原的分泌表达而造成的,本研究表明pre-S缺失突变、pre-S2起始密码子突变和“a”决定簇中的点突变均与HBsAg漏检具有相关性,但循环中HBsAg水平低于检测限也是另外一个重要的原因。本研究中发现的“a”决定簇点突变主要在以下位点: I/T126S/N/L、Q129N/R/P/H、D144E/G、G145R/A、G130N、T131N和M133T/I。在异常血清学检测模式中,pre-S/S突变往往表现为多重变异以及不同突变株或突变株与野生型的混合感染。与报道相比,作为免疫逃避主要突变位点的G145R突变并不常见。关于HBV preS/S基因突变与免疫逃避的关系,目前不同的研究有不同的结论,这可能与不同地域HBV流行株变异有关。换言之,免疫压力下不同基因型或基因亚型可能产生不同类型的突变。本研究中pre-S缺失突变和pre-S2起始密码子突变全部发生在基因型C中。总之,异常血清学检测模式往往与HBVpre-S/S基因突变相关,DNA检测和突变株检测对于这些标本尤为重要。pre-S/S基因突变可造成HBsAg血清学漏检,HBV低水平携带者的低抗原量造成的漏检同样值得注意。HBV隐匿性感染不仅可以造成临床诊断失误,更为严重的是献血员HBV隐匿性感染造成血液的污染。提高HBsAg突变株和低抗原量的检测能力尤为重要。
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相关论文文献
- [1].大连地区无偿献血者隐匿性乙型肝炎病毒感染pre-S/S区基因分析[J]. 中国输血杂志 2015(01)
- [2].无偿献血者隐匿性乙型肝炎病毒Pre-S/S区变异的研究[J]. 中国输血杂志 2011(07)
- [3].乙型肝炎病毒Pre-S/S区基因突变对乙型肝炎病毒表面抗原检测的影响[J]. 检验医学 2018(10)
- [4].深圳地区无偿献血者HBsAg-/HBV DNA+流行率与Pre-S/S区分子生物学特性[J]. 中国输血杂志 2012(S1)