论文摘要
目的构建汉坦病毒（Hantavirus,HV）GM04-38株包膜糖蛋基因G1、G2的真核表达载体,并将其在Vero E6细胞中进行表达,研究其表达特点,并且观察细胞融合现象的发生,为研究汉坦病毒基因结构与功能、病毒糖蛋白的结构与功能、研制有效的汉坦病毒基因工程亚单位疫苗奠定基础。构建汉坦病毒糖基化位点的突变体,对以后研究糖基化位点改变对细胞融合的影响具有重要意义。方法根据GenBank SEO型HV M、S片段cDNA基因保守序列及相关参考文献设计引物,以质粒pUCm-M1和pMD18-M2为模板,应用PCR方法分别扩增HV糖蛋白G1、G2的全长基因,并在基因两端创建相应的酶切位点,将PCR产物和表达载体pCAGGS/MCS分别双酶切后连接,转化大肠杆菌DH5α,经氨苄筛选,酶切和测序鉴定正确后,两种载体分别命名为pCAGGS-G1、pCAGGS-G2,然后将两种糖蛋白载体共转染Vero E6细胞,酸性MEM处理、Giemsa染色后观察细胞融合现象的产生。同时用pCAGGS-NP与两种糖蛋白载体共表达,看核蛋白是否对糖蛋白的融合有增强作用,并以间接免疫荧光实验（indirect immunofluorescence assay,IIFA）来观察糖蛋白和核蛋白的表达情况。利用基因定点突变的方法构建了五个糖蛋白突变体,即将G1、G2上的的天冬酰胺置换为丙氨酸,根据被替换的位置,突变体分别命名为N134A、N235A、N347A、N399A、N928A。结果1.构建了含有包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表达载体pCAGGS-G1和pCAGGS-G2,双酶切鉴定目的片段分别为2.0kb和1.5kb,载体片段为4.7kb并测序证实。2.间接免疫荧光试验显示糖蛋白组、核蛋白组及两者的共表达组皆有亮绿色荧光信号产生,呈胞浆分布。3.糖蛋白G1、G2共转染后在偏酸性条件下可引起Vero E6细胞发生融合,而转染pCAGGS-NP的细胞则没有融合现象发生;将核蛋白与糖蛋白共表达后也未出现明显的促进效应。4.构建了五个N-连糖基化位点的突变体,测序图谱显示原序列中的天冬酰胺（N）均被置换为丙氨酸（A）。结论成功构建了汉坦病毒包膜糖蛋白基因G1、G2的真核表达载体并在Vero E6细胞中有效表达,二者的共表达可以产生良好的生物学活性,在酸性条件下引起Vero E6细胞发生融合。为进一步研究糖蛋白的结构与功能,制备有效的亚单位疫苗奠定了坚实基础。成功构建了各糖基化位点的突变体,为进一步研究N-连糖基化的缺失对细胞融合的影响提供了必要条件。
论文目录
相关论文文献
- [1].植物多糖的生物学活性研究进展[J]. 饲料工业 2016(22)
- [2].重组人粒细胞集落刺激因子的生物学活性分析[J]. 中国生物制品学杂志 2013(04)
- [3].单克隆抗体类药物体外生物学活性检测方法概述[J]. 药物生物技术 2020(03)
- [4].重组人促红细胞生成素生物学活性细胞学测定方法的建立[J]. 海峡药学 2019(01)
- [5].植物多糖生物学活性研究进展[J]. 大理学院学报 2012(06)
- [6].猪脾转移因子的制备和生物学活性研究[J]. 川北医学院学报 2016(02)
- [7].猫白介素18基因的克隆、表达及其产物的生物学活性分析[J]. 中国预防兽医学报 2020(06)
- [8].聚乙二醇修饰重组人粒细胞集落刺激因子的生物学活性验证[J]. 深圳职业技术学院学报 2018(01)
- [9].正确的高级结构是蛋白质生物学活性的基本前提[J]. 生物学教学 2015(11)
- [10].重组人β-神经生长因子在昆虫细胞中的表达、纯化及其生物学活性[J]. 中国生物制品学杂志 2013(03)
- [11].黄酮类化合物生物学活性研究进展[J]. 草业科学 2010(06)
- [12].黄土高原退耕坡地不同类型林分土壤生物学活性的研究[J]. 西北林学院学报 2016(04)
- [13].重组猪表皮生长因子在酿酒酵母中的克隆表达及其生物学活性鉴定[J]. 畜牧兽医学报 2014(12)
- [14].肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌影生物学活性的初步研究[J]. 安徽医科大学学报 2012(09)
- [15].体外贮存对人富血小板血浆生物学活性的影响[J]. 北京大学学报(医学版) 2008(01)
- [16].蜜蜂巢脾的生物学活性研究进展[J]. 天然产物研究与开发 2012(12)
- [17].肾素-血管紧张素系统在骨生物学活性中的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志 2010(01)
- [18].蜂胶的提取技术及药理作用研究进展[J]. 中国蜂业 2013(31)
- [19].番茄红素生物学活性研究进展[J]. 食品工业科技 2013(16)
- [20].真核表达的重组猪单链IL-12生物学活性的研究[J]. 细胞与分子免疫学杂志 2012(07)
- [21].壳寡糖的制备及生物学活性研究进展[J]. 生命的化学 2019(04)
- [22].重组人促红素在2种品系小鼠体内的生物学活性的比较[J]. 药物分析杂志 2013(05)
- [23].大蒜素的生物学活性及应用研究现况[J]. 泰山医学院学报 2017(05)
- [24].中药成分的生物学活性评价及筛选[J]. 中草药 2015(04)
- [25].人体表皮生长因子受体3研究进展[J]. 陕西医学杂志 2013(03)
- [26].腮腺多形性腺瘤术后复发的生物学活性研究[J]. 实用癌症杂志 2008(06)
- [27].螺旋藻的化学成分、生物学活性和应用范围的研究概述[J]. 生物学教学 2020(02)
- [28].不同代数去卵巢骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的生物学活性综合评价[J]. 生物医学工程学杂志 2016(05)
- [29].安佰诺工艺变更前后生物学活性可比性统计方法探讨[J]. 中国新药杂志 2019(01)
- [30].猪白细胞介素-2基因的原核表达、纯化及其生物学活性[J]. 中国生物制品学杂志 2013(12)