Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定、表达及序列分析

论文摘要

微生物谷氨酰胺转胺酶（Microbial Transglutaminase,简称MTG,EC 2.3.2.13）能催化多种蛋白质分子间、分子内的酰基转移反应,改善各种蛋白质的功能性质,在食品、化妆品、制药等工业领域具有广阔的应用前景。为鉴定来源于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因;研究其在大肠杆菌系统的表达;分析该酶与其同源酶的活性中心氨基酸序列及其三维结构,本论文主要研究内容如下:1.提取吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus;CCTCC M203062）的总DNA,利用纯化得到的天然谷氨酰胺转胺酶酶原（pro-MTGase）,测定N-端前十个氨基酸序列,以及根据NCBI数据库不同微生物来源的MTGase基因保守序列设计引物,完整的克隆得到Streptomyces hygroscopicus来源的pro-MTGase基因序列。本研究是对吸水链霉菌来源的TGase基因的首次报道。2.对目的基因进行测序,确定吸水链霉菌pro-MTGase基因共1170bp,编码389个氨基酸,其碱基序列与其它链霉菌来源的同源性较高,与Streptomyces caniferus, Streptomyces platensis, Streptomyces paucisporogenes等同源性高达92%。氨基酸序列1-58位为pro-region;59-389位共331个氨基酸为成熟酶编码区;第122位氨基酸Cys为活性中心位点,成熟酶分子中催化三联体为‘Cys64-His274-Asp255’与其它链霉菌来源的同源酶一致。3.利用pET-20b（+）载体系统构建了多种表达载体,通过宿主菌BL21（DE3）进行诱导表达始终形成包涵体,而利用宿主菌Rosetta（DE3）pLysS获得了少量的胞外可溶性表达。通过培养及诱导条件的研究,确定37℃培养至OD600=1.5,添加IPTG终浓度0.4mmol/L,降温到24℃诱导24h,得到发酵上清液最高酶活0.35U/mL。SDS-PAGE显示,胞外表达重组蛋白的分子量约为44 kDa,与吸水链霉菌表达的天然酶原大小相符。这也是在国内首次利用大肠杆菌系统实现了MTGase的可溶性胞外表达。4.对吸水链霉菌的MTGase基因利用生物信息学手段进行序列分析、二级结构预测及三维结构建模,发现其二级结构由许多α螺旋、转角和少量β折叠构成;活性中心位点氨基酸残基Cys在转角的一个疏水区内,以便保持稳定;对催化三联体的催化机理进行初步研究;同源建模预测的三维结构基本能真实的反映MTGase空间构象,为进一步探究MTGase结构和功能的关系、蛋白分子定向改造、化学修饰以及工业化的研究提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 谷氨酰胺转胺酶的功能性质
• 1.2.1 谷氨酰胺转胺酶的来源
• 1.2.2 谷氨酰胺转胺酶的作用机理
• 1.2.3 谷氨酰胺转胺酶在食品工业中的应用
• 1.3 谷氨酰胺转胺酶的市场前景
• 1.4 谷氨酰胺转胺酶的生产
• 1.4.1 传统的生产方式
• 1.4.2 基因工程表达
• 1.5 大肠杆菌系统高效表达外源蛋白的策略
• 1.6 立题背景和意义
• 1.7 主要研究内容
• 第二章 Streptomyces hygroscopicus 谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 工具酶、试剂及主要仪器
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 S. hygroscopicus pro-MTGase 的N-端氨基酸序列
• 2.3.2 pro-MTGase 的胰蛋白酶活化条件确定
• 2.3.3 S.hygroscopicus 总DNA 的提取
• 2.3.4 pro-MTGase 的PCR 扩增及克隆
• 2.3.5 pro-MTGase 基因序列的测定
• 2.4 本章小结
• 第三章 谷氨酰胺转胺酶在大肠杆菌中的表达
• 3.1 引言
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 菌种和质粒
• 3.2.2 PCR
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 主要仪器及试剂
• 2 法）'>3.2.5 感受态细胞制备（CaCl₂法）
• 3.2.6 转化
• 3.2.7 培养及诱导
• 3.2.8 超声破碎
• 3.2.9 重组酶原的活化
• 3.2.10 谷氨酰胺转胺酶酶活测定
• 3.2.11 SDS-PAGE
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 表达载体的构建
• 3.3.2 重组菌BL21/pET-MTG-His 的诱导表达
• 3.3.3 重组菌BL21/pET-MTG 的诱导表达
• 2 的诱导表达'>3.3.4 重组菌BL21/pET-MTG²的诱导表达
• 3.3.5 Rosetta/pET-MTG 的诱导表达
• 3.4 本章小结
• 第四章 Streptomyces hygroscopicus 谷氨酰胺转胺酶序列分析及三维结构建模
• 4.1 引言
• 4.2 材料和方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 pro-MTGase 序列分析
• 4.2.3 S. hygroscopicus MTGase 的同源建模
• 4.2.4 活性中心组氨酸的化学修饰
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 pro-MTGase 序列同源性分析
• 4.3.2 活性中心氨基酸序列分析
• 4.3.3 pro-MTGase 二级结构及跨膜结构域分析
• 4.3.4 吸水链霉菌MTGase 三维建模分析
• 4.3.5 组氨酸在MTGase 的催化过程中的作用
• 4.4 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录