论文摘要
问题的提出及研究背景人们发现肿瘤细胞能表达肿瘤抗原,机体的免疫系统通过对其做出免疫反应能将抗原清除。那么机体罹患肿瘤后能否对相应肿瘤产生特异性免疫?通过提高机体对相应肿瘤的特异性及非特异性免疫反应,能否阻止相应肿瘤的复发或者再发?能否确实地抑制或消退肿瘤,延长无病间期及生存期?这是肿瘤免疫治疗中人们所关心的重要问题。已有的研究结果多从正面、肯定的角度回答了这一问题。但是对这类回答的结果通常与临床实际并不吻合,恶性肿瘤的不断发展及复发是不争的事实。为此我们设计了本课题,试图通过严密的动物实验来回答上述问题。对动物模型和肿瘤病人的观察提示,肿瘤在体内的排斥控制主要依赖于肿瘤抗原特异性T淋巴细胞。因此,T细胞被认为是肿瘤疫苗理想的效应细胞。肿瘤患者体内的T淋巴细胞通过T细胞抗原受体（TCR）与肿瘤细胞表面表达的人白细胞抗原（human leucocyte antigen,HLA）-抗原肽复合物的相互作用来识别其靶分子。HLA-抗原肽复合物是由蛋白质衍生的片段（肽或表位）构成,提呈于特异的HLA顶端的槽内。抗原肽通常是9到20个氨基酸的长度,由细胞表达的蛋白质（抗原）通过加工和切割所形成。参与抗瘤效应的T细胞主要依靠CD4+T细胞及CD8+T细胞两个亚群。在抗原提呈细胞的参与下,CD4+T细胞可识别瘤细胞分泌的可溶性抗原,并参与B细胞、巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞（cytotoxic Tlymphocyte,CTL）的激活,进而发挥抗瘤作用。CD8+T细胞的杀伤活性则在机体抗肿瘤效应中起关键作用。CD8+CTL通过其受体TCR识别主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）Ⅰ类分子结合的肿瘤抗原肽,被激活后增生分化为具有杀瘤活性的CTL杀伤肿瘤细胞。肿瘤疫苗治疗肿瘤的机理就在于利用肿瘤抗原激发和增强机体的特异性的抗肿瘤免疫反应,来达到治疗肿瘤的目的。近年来,肿瘤免疫治疗被认为是非常有吸引力的第四类肿瘤治疗方法。尤其在面对传统治疗方法的许多缺点的时候,肿瘤免疫治疗成为治疗肿瘤的新希望。目前研究者们正深入研究各种不同类型的疫苗,从灭活的全细胞疫苗到基因修饰肿瘤疫苗、肽和蛋白质疫苗及DNA疫苗等。虽然在许多动物实验及临床试验中,人们用各种证据证明了这些疫苗可以引起机体的特异性免疫反应,但是仍然不能阻止肿瘤的恶性进展。因此,肿瘤疫苗及肿瘤免疫的有效性依然是需要再研究的重要问题。我们就这一问题进行了探讨。我们采用自体肿瘤全细胞疫苗（包含了肿瘤细胞表面的所有抗原并且拥有个体特异性的HLA分子,比异体肿瘤细胞更安全有效）形式,选用C57BL/6小鼠及来源于C57BL/6小鼠的Lewis肺腺癌细胞（Lewis LungCarcinomal cell,LLC）来进行研究。旨在回答自发性肿瘤能否引起机体的特异性免疫反应,回答自体肿瘤疫苗作为疫苗的有效性和可行性,为肿瘤细胞免疫治疗的选择提供依据。材料与方法一、Lewis肺腺癌细胞免疫原性的实验研究实验分为2部分:二次成瘤实验及小鼠免疫学指标检测。1.二次成瘤实验分为2组:实验组和对照组,每组各28只小鼠。实验组小鼠右腋下接种LLC肿瘤细胞后第12天,将成瘤后的肿瘤切除并制成细胞悬液,接种于原小鼠的左腋下;同时将同样的肿瘤细胞悬液接种于正常小鼠左腋下,作为对照组。观察两组小鼠的成瘤情况,HE染色观察瘤组织形态。2.小鼠免疫学指标检测实验分为2组:荷瘤组和正常组,每组各10只小鼠。荷瘤组小鼠右腋下接种LLC肿瘤细胞,正常组小鼠右腋下注射生理盐水,第12天取外周血及脾脏;流式细胞术检测小鼠外周血中淋巴细胞亚群比例,MTT法检测脾淋巴细胞转化率。二、Lewis全细胞瘤苗对C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用的实验研究实验分为2部分:小鼠免疫学指标检测及小鼠体内成瘤实验。1.小鼠免疫学指标检测,实验分为3组:LLC瘤苗组,佐剂对照组及正常组,每组各10只小鼠。①LLC瘤苗组疫苗为灭活的LLC细胞与完全弗氏佐剂乳化制成,佐剂对照组疫苗为生理盐水与完全弗氏佐剂乳化制成,正常组疫苗为生理盐水。②免疫方法:小鼠左前肢及左后肢各肌注疫苗50μl,每周1次,共免疫4次。其中LLC瘤苗组及佐剂对照组第一次免疫为含弗氏佐剂油剂疫苗,第2、3、4次为灭活LLC细胞或生理盐水,正常组4次免疫均为生理盐水。③完成免疫后,三组小鼠均取外周血及脾脏,流式细胞术检测小鼠外周血中淋巴细胞亚群比例;血清凝集试验检测LLC特异性抗体;双抗夹心ELISA法检测IgG抗体;MTT法检测脾淋巴细胞转化率;台盼蓝法检测细胞毒性T细胞杀伤率。2.小鼠体内成瘤实验,实验分为3组:LLC瘤苗组,佐剂对照组及正常组,每组各10只小鼠。①三组小鼠均予疫苗免疫,疫苗及免疫方法同前。②在第4次免疫的同时,三组小鼠均于右腋下接种LLC活细胞,观察成瘤率、成瘤时间及生存期;取肿瘤组织及接种疫苗局部组织行HE染色,观察其形态学变化。实验结果一、Lewis肺腺癌细胞的免疫原性1.实验组C57小鼠第一次右腋下皮下接种Lewis肺腺癌细胞,成瘤率为100%,手术切除肿瘤后于对侧皮下第二次接种Lewis肺腺癌细胞,成瘤率为89.3%,与第一次接种及对照组的成瘤率（100%）相比差异无统计学意义（P=0.236）;实验组小鼠右腋下肿瘤切除后复发率为96.4%。与第一次接种成瘤率相比,差异无统计学意义（P=0.313）;2.HE染色显示小鼠第一次及第二次成瘤的瘤组织形态无明显差异,第一及第二次成瘤的瘤组织内均未见明显淋巴细胞浸润及纤维组织增生;3.荷瘤组与正常组相比,其外周血中CD4+、CD8+、CD19+淋巴细胞亚群的差异均无统计学意义（P＞0.05）;4.荷瘤组与正常组相比,其脾淋巴细胞转化率相近,差异也无统计学意义（P＞0.05）。二、Lewis细胞瘤苗对C57BL/6小鼠Lewis肺癌抑制作用1.LLC瘤苗组、佐剂对照组、正常组小鼠成瘤率均为100%。LLC瘤苗组、佐剂对照组、正常组小鼠成瘤时间分别为8.7天、8.1天、7.3天,差异有统计学意义（P=0.030）。其中两两比较LLC瘤苗组与佐剂对照组之间差异无统计学意义（P=0.693）,LLC瘤苗组与正常组之间差异有统计学意义（P=0.009）。LLC瘤苗组、佐剂对照组及正常组小鼠中位生存时间分别为33、33、36天,三者比较差异无统计学意义（P=0.254）;2.HE染色显示LLC疫苗组、佐剂对照组及正常组免疫后接种LLC细胞,其成瘤瘤组织形态无明显差异,瘤组织内均未见明显淋巴细胞浸润;LLC疫苗组及佐剂对照组接种疫苗局部组织均可见结缔组织水肿、粘液样变性、纤维素性变性,少量淋巴细胞浸润,并普遍出现淋巴管样结构。3.三组小鼠比较,外周血CD4+、CD8+T淋巴细胞亚群的百分比差异无统计学意义,CD4+/CD8+比值差异也无统计学意义;三组小鼠CD19+B细胞百分比中正常组最高,其次为LLC瘤苗组,佐剂对照组外周血CD19+B细胞百分比最低,差异有统计学意义（P=0.000）,但两两比较LLC瘤苗组与佐剂对照组之间差异无统计学意义（P=0.251）。4.LLC瘤苗组和佐剂对照组及正常组小鼠血清分别与灭活LLC细胞混合后,混合物为淡黄色,清亮,未见流沙样凝集物出现,结果均为阴性。5.LLC瘤苗组和佐剂对照组及正常组小鼠血清IgG抗体浓度分别为28.82ng/ml、21.43ng/ml、23.32ng/ml。其中LLC瘤苗组小鼠血清IgG抗体浓度最高,其次为正常组小鼠血清IgG抗体浓度,但差异无统计学意义（P=0.165）。6.三组小鼠脾淋巴细胞转化率比较差异无统计学意义（P=0.063）,LLC瘤苗组和佐剂对照组小鼠脾淋巴细胞转化率均略高于正常组小鼠;LLC疫苗组和佐剂对照组小鼠脾淋巴细胞转化率接近;7.细胞毒性实验结果表明三组小鼠细胞毒性T细胞对LLC细胞的杀伤率差异无统计学意义（P=0.535）;三组小鼠细胞毒性T细胞对782细胞杀伤率差异也无统计学意义（P=0.931）。细胞毒性T细胞对LLC细胞与782细胞杀伤率比较,差异无统计学意义（P=0.241）。结论一、Lewis肺腺癌细胞对于C57BL/6小鼠为低免疫原性肿瘤细胞株。至少存在机体对同种属低免疫原性肿瘤细胞不产生免疫识别,所以再次遇到相同肿瘤细胞时不能产生有效的免疫杀伤或免疫抑制作用。二、添加完全弗氏佐剂的Lewis肺腺癌全细胞瘤苗不能增强C57BL/6小鼠的特异性和非特异性免疫功能,也不能使小鼠获得有效的免疫保护。这提示对于同种属低免疫原性肿瘤细胞,即便添加佐剂,也未必能增强机体对该肿瘤的免疫杀伤作用和延长荷瘤机体的生存期,即不能提高对机体的免疫保护作用。