二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究

论文摘要

第一章卵巢癌多药耐药的研究进展（文献综述）卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一。卵巢隐匿于盆腔的深部,早期病变时不易被发现,一旦出现症状时大多属于晚期,治疗后容易复发,死亡率亦一直位居妇科恶性肿瘤之首。目前卵巢癌的治疗目的是早期争取治愈、晚期控制复发、延长生存期及提高患者生活质量。治疗原则是以手术为主,联合化疗及放疗的综合治疗。大多数的情况下,手术是很难将卵巢癌的转移灶彻底的切除干净。对于那些残留的细小的转移和种植结节.都需要化学药物来进行治疗。因此,化疗在卵巢癌治疗的过程中具有极其重大的意义。晚期卵巢癌的治疗方法主要以肿瘤细胞减灭术及术后辅助化疗为主。但化疗失败常会导致卵巢癌的复发,其主要原因在于肿瘤细胞产生的多药耐药（multidrug resistance,MDR）。以顺铂为主的联合化疗对卵巢癌的有效率达40%-60%,由于疾病进展和机体对化疗产生耐药,晚期卵巢癌患者的5年生存率低于20%。所以,多药耐药是肿瘤化疗失败的主要因素之一。因此,肿瘤产生耐药机制的研究以及在临床上预防耐药、对抗耐药并尝试逆转耐药就成为了当前卵巢癌治疗中的热点和难点,成为提高卵巢癌的治疗效果及改善卵巢癌患者生存的重要目标之一。第二章卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义目的探讨卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因（DHFR）（?）的表达及其临床意义。方法采用实时荧光定量PCR法测定80例卵巢癌组织、50例良性卵巢组织及30例正常卵巢组织中的DHFR mRNA表达情况,分析其与卵巢癌临床病理及多药耐药的相关性。结果（1）DHFR mRNA表达量在止常卵巢,良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中分别为0.584±0.234,0.895±0.783和0.197±0.412,相比较差异有统计学意义（P<0.001,P=0.027,P<O.001）。（2）卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者临床分期及病理分级无相关（P>O.05）,但在上皮性癌中浆液性癌组织中DHFR mRNA表达量则明显高于粘液性和内膜样癌,相比较差异有统计学意义（P<0.001）。（3）卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与患者的腹水量,淋巴结转移和远处器官转移无明显相关（P>O.05）,但大网膜转移者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量则低于无转移者（P=0.044）。（4）在卵巢癌患者中治疗后缓解者组织中DHFR mRNA表达量低于肿瘤进展者（P<O.001）；而铂类药物敏感型患者肿瘤组织中DHFR mRNA表达量也低于铂类药物耐药者（0.130±0.103vs0.341±0.701P=0.011）。（5）DHFR mRNA表达量判断卵巢肿瘤性质的ROC曲线Youden旨数最大值所对应的数值为0.331, DHFR mRNA表达量高于0.331的患者中位生存时间为16.4个月,而低于0.331的患者中位生存时间为44.5个月,著异有统计学意义（P<0.001）,且COX模型多因素分析亦显示DHFR mRNA表达量为影响预后的独立因素（P=0.018）。结论DHFR mRNA在正常和良性卵巢组织中表达量高于卵巢癌组织,提示DHFR参与正常组织细胞生理代谢；而在卵巢癌中DHFR mRNA在铂类耐药组织中高表达（O.341±0.701）,在铂类敏感组织低表达（0.130±0.103）,提示DHFR与卵巢癌多药耐药相关,可能为判断卵巢癌多药耐药潜在标志之一。第三章二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮癌细胞系生物学特性影响的体外实验研究目的构建携带人二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的慢病毒表达载体pWPI。方法采用PCR方法扩增二氢叶酸还原酶cDNA全长,与EZ-T克隆载体连接,HindⅢ及BamHI-HF限制性内切酶双酶切回收的PCR片段并补平其缺口。慢病毒系统载体使用pWPI系统,采用PmeI酶切载体后回收片段,将其磷酸化,T4酶连接载体与目的基因。表达载体鉴定均采用核苷酸序列测定,重组质粒采用脂质体转染293T包装细胞后获得包装的病毒颗粒。通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pWPI-SKOV3细胞、空载pWPI-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下（2.5ug/ml,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1）不同时间段（24h、48h及72h）的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）下三种细胞的周期变化,高效液相法（HPLC法）检测不同顺铂浓度（4.0ug/ml,6.0ug/ml,8.0ug/ml）不同时间段（24h、48h及72h）药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的过表达对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果（1）成功扩增二氢叶酸还原酶全长并连接入pWPI载体构建成重组表达载体DHFR-pWPI,重组质粒测序结果显与DHFR基因的同源性达100%,按标准生产程序转染293T后有DHFR基因的表达,将其病毒液感染SKOV3细胞。（2）通过流式细胞仪检测转染DHFR基因的细胞的凋亡变化,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度（2.5ug/ml、5.0ug/m1）刺激下,其24h、48h及72h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；DHFR-pWPI-SKOV3细胞在顺铂浓度（10.0ug/ml、20.0ug/ml）刺激下,其24h及48h的凋亡率均低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞,但在72h时,凋亡率却高于SKOV3细胞株。表明DHFR-pWPI-SKOV3细胞在浓度小于5.0ug/ml时,不管时间的改变（72小时内）,其对顺铂的抵抗力高于其他两种细胞。（3）通过流式细胞仪检测不同时间段IC50顺铂浓度（6.0ug/m1）对三种不同处理卵巢癌细胞的周期变化,结果提示1C50（6.0ug/m1）顺铂浓度给药时,DHFR-pWPI-SKOV3、pWPI-SKOV3及SKOV3三种细胞在24h、48h时其G1期含量明显低于G2+S细胞：而在72h时,DHFR-pWPI-SKOV3细胞的G2+S期明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。（4）采用HPLC法检测细胞内顺铂浓度,结果显示细胞培养液中顺铂浓度（4.0ug/m1）给药24h、48h后及顺铂浓度（6.0ug/m1）给药24h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量均明显低于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞；顺铂浓度（6.0ug/m1）给药48h及顺铂浓度（8.0ug/ml）给药24h、48h后,DHFR-pWPI-SKOV3细胞内的顺铂含量明显高于pWPI-SKOV3及SKOV3细胞。（5）通过电镜观察1C50顺铂浓度在不同时间段刺激三种不同处理的细胞的超微结构改变,发现DHFR-pWPI-SKOV3细胞在给药24h及48h其微丝聚集,线粒体从数量上及结构上改变明显,而pWPI-SKOV3细胞微丝少见,线粒体数目减少,但结构改变不明显,SKOV3细胞亦很少见到微丝,但其线粒体的结构改变亦明显,扩张与固缩同时存在；三者均出现扩张的内质网；三者均少见正常的细胞器；在给药72h后,pWPI-SKOV3及SKOV3细胞可见微丝排列紊乱,核膜部分消失,核糖体大量的聚集,进入了明显的坏死阶段,而DHFR-pWPI-SKOV3细胞未见微丝,核膜几乎完全消失,胞质内有白色囊状物质,线粒体结构基本消失,大部分细胞濒临死亡。结论成功采用慢病毒载体系统构建了二氢叶酸还原酶重组慢病毒转基因,耐药性功能实验表明DHFR表达量增高时卵巢癌细胞系耐药性增加,可以认为DHFR与卵巢癌顺铂的耐药性相关,为探讨DHFR在肿瘤多药耐药过程中的分子机理奠定基础。第一节RNA干扰质粒载体的构建及鉴定目的构建二氢叶酸还原酶（DHFR, dyhidrofolate reductase）基因RNAi慢病毒载体,为探讨抑伟DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入p GSCIL载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。结果将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGPU6/GFP/Neo载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,PCR鉴定干扰效果。G418筛选稳定细胞株。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。第二节DHFR慢病毒干扰载体的构建及其在卵巢上皮癌细胞中生物学特性影响目的构建二氢叶酸还原酶（DHFR, dyhidrofolate reductase）基因RNA干扰慢病毒载体,研究其耐药性功能影响,为探讨抑制DHFR基因表达在卵巢癌铂类耐药治疗中的意义奠定基础。方法设计DHFR基因靶向的发夹状siRNA,筛选出最佳siRNA沉默片段,退火后连接入pGSCIL/GFP载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染SKOV3细胞株,并进行荧光摄像。Western blot验证构建成功通过流式细胞仪检测成功构建好的DHFR-pGSCIL-SKOV3细胞、空载pGSCIL-SKOV3细胞以及亲本SKOV3细胞在不同的顺铂浓度下（2.5ug/m1,5.0ug/ml,10.0ug/ml,20.0ug/m1）不同时间段（24h、48h及72h）的三种细胞的凋亡情况以及IC50顺铂浓度（4.4ug/ml）下三种细胞的周期变化,高效液相法（HPLC法）检测不同顺铂浓度（2.5ug/ml,5.0ug/ml,7.5ug/ml）不同时间段（24h、48h及72h）药物作用后三种细胞内的顺铂浓度,以及透射电镜观察IC50顺铂浓度（4.4ug/m1）下三种细胞的超微结构变化,以探讨DHFR基因的沉默对卵巢癌细胞的体外生物学行为影响。结果（1）将退火后的双链寡核苷酸片段连接至pGSCIL/GFP载体,测序结果正确。转染SKOV3细胞后,Western blot鉴定十扰效果。（2）在给药24h、48h及72h,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞的凋亡率随着顺铂浓度（2.5ug/ml、5.0ug/ml、10.0ug/ml、20.0ug/m1）的增大而升高,且DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞给药48h及72h后的凋亡率明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。（3）在IC50（4.4ug/ml）顺铂浓度给药24h、48h后,DHFR-pGCSIL-SKOV3、pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞均以G1期为主。DHFR-pGCSIL-SKOV3在48h时G1期的细胞比例明显减少,S期和G2/M期比例增多,72h后三种细胞G1期的含量均明显降低,S期和G2/M期的含量均增高。（4）采用高效液相检测细胞内顺铂浓度时,当2.5ug/m1、5.0ug/ml顺铂浓度作用三种不同处理的卵巢癌细胞时,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在给药后24h、48h其细胞内顺铂浓度均明显高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。而DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在7.5ug/ml顺铂浓度给药后24h其细胞内顺铂浓度均明显低于PGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞,而在48h却又高于pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞。（5）在IC50（4.4ug/m1）给药24h、48h三种不同处理细胞的微丝均少见,DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞在24h时可见线粒体肿胀、脊消失、空泡化、萎缩,内质网扩张明显,有聚集的核糖体,末见高尔基体,48h时其有些线粒体溶解消失,且出现大量的白色囊泡；而pGCSIL-SKOV3及SKOV3细胞24h、48h内质网扩张少见,线粒体结构改变不明显,甚至有2-3个高尔基体存在；DHFR-pGCSIL-SKOV3细胞至72h时,微丝明显的聚集、增多,线粒体结构亦消失。余两种细胞微丝排列紊乱,线粒体形态多样化。结论成功构建针对DHFR基因的siRNA慢病毒载体,找到了有效的干扰靶序列,转染SKOV3细胞后,DHFR基因的表达明显减弱。通过对DHFR下调后耐药性功能研究证实DHFR基因的下调与经过铂类药物作用的体外卵巢癌细胞的药物敏感性有一定的联系,抑制DHFR基因表达能增加顺铂药物敏感性,因此,抑制卵巢癌细胞DHFR基因的表达可以考虑作为顺铂多药耐药的逆转机制。

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ABSTRACT

第一章卵巢癌多药耐药的研究进展（文献综述）

1.卵巢上皮癌一线化疗模式及存在的问题

1.1 卵巢上皮癌一线化疗方案选择

1.2 一线化疗方案总体疗效评价

1.3 卵巢上皮癌一线化疗存在的问题

2.卵巢癌多药耐药的概念

3.卵巢癌多药耐药的临床表现

4.卵巢癌多药耐药的诊断

4.1 血清CA125对卵巢癌多药耐药的诊断价值

4.2 血清HE4对卵巢癌多药耐药的诊断价值

4.3 其他肿瘤标志物

5.卵巢癌多药耐药发生的机理

5.1 卵巢癌多药耐药发生的相关临床病理因素

5.2 影响卵巢癌一线化疗疗效的相关临床病理因素

5.3 卵巢癌多药耐药发生的分子机理

5.3.1 细胞内化疗药物的外排机制

5.3.2 细胞内化疗药物代谢解毒增加

5.3.3 细胞内DNA修复增加

5.3.4 信号传导通路障碍的机制

5.3.5 细胞凋亡异常的机制

5.3.6 其它机制

6.卵巢癌多药耐药的治疗

6.1 降低卵巢癌多药耐药发生的化疗对策探索

6.1.1 一线标准方案中加入其它化疗药物的RCT结果

6.1.2 一线标准方案用药途径改变的RCT结果

6.1.3 一线标准方案用药时间及强度改变的RCT结果

6.1.4 一线标准化疗完成后巩固化疗的RCT结果

6.1.5 术前新辅助化疗的RCT结果

6.2 卵巢癌多药耐药的预防

6.3 卵巢癌多药耐药的临床分型及治疗目的

6.4 卵巢癌多药耐药的手术治疗

6.4.1 卵巢癌多药耐药患者手术的适应征与禁忌征

6.4.2 卵巢癌多药耐药患者手术的主要方式与疗效评价

6.4.3 影响卵巢癌多药耐药患者手术疗效的临床病理因素

6.5 卵巢癌多药耐药的化疗

6.5.1 卵巢癌多药耐药患者化疗的适应征与禁忌征

6.5.2 单纯的CA125升高是否适合化疗

6.5.3 卵巢癌多药耐药患者化疗的方案选择与疗效评价

6.5.4 影响卵巢癌多药耐药患者化疗疗效的临床病理因素

6.6 卵巢癌多药耐药的靶向治疗

6.6.1 EGFR（表皮生长因子受体）拮抗剂

6.6.2 血管生长阻滞剂（贝伐单抗等）

6.6.3 信号转导抑制剂

6.6.4 抗FRA人源化单克隆抗体

6.6.5 mTOR抑制剂

6.6.6 PARP抑制剂

6.6.7 DNA甲基转化酶抑制剂

6.7 卵巢癌多药耐药的其它治疗

6.7.1 抗肿瘤MDR基因治疗

6.7.2 多药耐药的逆转耐药治疗

7.二氢叶酸还原酶与肿瘤多药耐药关系的研究

7.1 二氢叶酸还原酶结构与生物学作用

7.2 二氢叶酸还原酶与肿瘤多药耐药的关系

7.3 二氢叶酸还原酶抑制剂的研究

8.本研究的目的和意义

参考文献

第二章卵巢癌组织中二氢叶酸还原酶基因的表达及临床意义

1.材料及方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本

1.1.2 载体及菌株

1.1.3 实验主要的仪器设备

1.1.4 主要试剂

1.1.5 部分试剂的配置

1.1.6 用具处理

1.1.7 引物的设计

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 卵巢组织总RNA提取

1.2.2 cDNA合成

1.2.3 DHFR及GAPDH基因扩增（RT—PCR）

1.2.4 PCR产物的纯化与回收

1.2.5 回收的PCR产物与EZ-Blunt载体连接

1.2.6 感受肽大肠杆菌DH-5α的制备

1.2.7 连接产物转化至感受态DH-5α

1.2.8 挑选阳性克隆

1.2.9 质粒DNA小提

1.2.10 检测连接是否成功

1.2.10.1 PCR法

1.2.10.2 测序

1.2.11 测序结果序列分析

1.2.12 制备标准品

1.2.13 实时荧光定量PCR

1.2.14 数据整理

1.2.15 统计分析

1.2.16 PCR检测基因突变

2.结果

2.1 DHFR基因和重组GAPDH基因质粒构建结果

2.2 实时荧光定量PCR检测卵巢癌DHFR mRNA的标准曲线与融解曲线的建立

2.3 DHFR测定的实时荧光扩增熔解曲线

2.4 各类卵巢组织中DHFR mRNA表达量的比较

2.5 卵巢癌组织中DHFR mRNA表达量与其临床病理因素的关系

2.6 卵巢癌患者组织中DHFR mRNA表达量与其转移关系

2.7 卵巢癌组织DHFR mRNA表达含量及其治疗疗效和耐药的相关性

2.8 卵巢癌组织中DHFR mRNA表达与其预后的关系

2.9 PCR检测耐药患者及敏感患者的基因突变

3.讨论

参考文献

第三章二氢叶酸还原酶基因表达上调对卵巢上皮癌细胞生物学特性的影响的体外实验研究

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1质粒与菌株、细胞

1.1.2 主要试剂

1.1.3 仪器

1.1.4 试剂的配制

1.2 实验方法

1.2.1 DHFR慢病毒表达系统的构建

1.2.1.1 DHFR全长的扩增及回收

1.2.1.2 PCR产物的纯化和回收

1.2.1.3 DHFR的定量

1.2.1.4 载体的准备

1.2.1.4.1 PmeI酶切pWPI

1.2.1.4.2 pWPI去磷酸化

1.2.1.5 DHFR与pWPI的连接

1.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌DH-5α

1.2.1.7 挑选阳性克隆

1.2.1.8 重组质粒的初步鉴定

1.2.1.9 质粒DNA的提取

1.2.1.10 重组质粒的PCR鉴定

1.2.1.11 重组质粒的测序

1.2.1.12 测序结果的序列分析

1.2.2 DHFR-pWPI转染293T细胞

1.2.3 病毒滴度测定

1.2.4 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量

1.2.5 病毒颗粒感染SKOV3细胞

1.2.6 转染效率的检测

1.2.7 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化

-△△Ct法)检测三组细胞中DHFR的含量'>1.2.7.1 荧光定量PCR(2^-△△Ct法)检测三组细胞中DHFR的含量

1.2.7.2 Western Blot检测三组细胞中DHFR的含量

1.2.8 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验

1.2.8.1 MTT法检测IC50

1.2.8.2 不同药物浓度、不同时间段的凋亡变化

1.2.8.3 IC50顺铂浓度6.0(Vg/mO不同时间段的周期变化

1.2.8.4 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化

1.2.8.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化

2.结果

2.1 重组质粒DHFR-pWPI PCR电泳结果

2.2 重组质粒DHFR-pWPI PCR测序结果

2.3 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量

2.4 DHFR-pWPI转染293T细胞结果

2.5 病毒滴度测定结果

2.6 病毒颗粒转染SKOV3细胞

2.7 转染效率的检测

2.8 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化

2.9 慢病毒介导SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验

2.9.1 MTT法检测IC50

2.9.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化

2.9.3 IC50顺铂浓度（6.0μg/ml）不同时间段的周期变化

2.9.4 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化

2.9.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化

3.讨论

参考文献

第四章 siRNA沉默DHFR基因对卵巢上皮癌生物学特性影响体外实验研究

第一节 RNA干扰质粒载体的构建及鉴定

1.1 材料

1.2 实验方法

1.2.1 干扰细胞系的选择

1.2.2 脂质体介导的DHFR-siRNA的转染

1.2.3 构建DHFR-pGPU6载体重组质粒

1.2.4 DHFR-pGPU6-768转染SKOV3细胞

1.2.5 携带干扰重组质粒的SKOV3细胞的筛选

1.2.6 携带干扰重组质粒的SKOV3细胞的克隆

1.2.7 RT-PCR及western-blot检测干扰效果的表达

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同种类卵巢癌细胞的DHFR基因表达情况

2.2 转染条件的确定

2.3 DHFR-pGPU6-768siRNA表达载体构建结果

2.4 DHFR-pGPU6-768载体转染SKOV3细胞结果

2.5 荧光PCR检测干扰后三种不同细胞株的DHFR表达量

2.6 DHFR-pGPU6-768-SKOV3和pGPU6-SKOV3细胞筛选

3.讨论

参考文献

第二节 DHFR慢病毒干扰载体的构建及其在卵巢上皮癌细胞中的生物学特性影响

1.1 材料

1.1.1 质粒与菌株、细胞

1.1.1.1 质粒

1.1.1.2 试剂

1.1.1.3 仪器

1.2 实验方法及步骤

1.2.1 实验总流程

1.2.1.1 siRNA 靶点设计

1.2.1.2 合成单链DNA oligo

1.2.1.3 引物退火形成带双链DNA oligo

1.2.1.4 pGCSIL/GFP质粒载体的线性化

1.2.2 重组pGCSIL/GFP质粒载体的构建和扩增

1.2.3 DHFR-PGCSIL/GFP转染

1.2.4 病毒滴度测定

1.2.5 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量

1.2.6 病毒颗粒感染SKOV3细胞

1.2.6.1 MOI值的预测

1.2.6.2 感染步骤

1.2.6.3 转染效率的检测

1.2.7 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化

-△△Ct法)检测三组细胞中DHFR的含量'>1.2.7.1 荧光定量PCR(2^-△△Ct法)检测三组细胞中DHFR的含量

1.2.7.2 Western Blot检测三组细胞中DHFR的含量

1.2.8 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验

1.2.8.1 MTT法检测IC50

1.2.8.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化

1.2.8.3 IC50顺铂浓度（4.4μg/ml）不同时间段的周期变化

1.2.8.4 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化

1.2.8.5 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化

1.3 统计学方法

2.结果

2.1 pGCSIL/GFP质粒载体酶切图及构建图

2.2 RNAi重组质粒测序结果

2.3 慢病毒包装图及病毒滴度的测定

2.4 病毒颗粒感染SKOV3细胞

2.5 不同卵巢癌细胞株DHFR的表达量

2.6 转染效率的检测

2.7 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞中DHFR含量的变化

2.8 慢病毒干扰SKOV3细胞DHFR表达前后细胞耐药性的生物学影响实验

2.8.1 MTT法检测不同时间段的IC50

2.8.2 不同药物浓度.不同时间段的凋亡变化

2.8.4 IC50顺铂浓度（4.4μg/ml）不同时间段的周期变化

2.8.5 不同时间段的IC50药物浓度的超微结构变化

2.8.6 不同药物浓度.不同时间段的细胞内外的铂类药物浓度变化

3.讨论

参考文献

全文小结

全文创新点

本研究存在的问题

第五章二氢叶酸还原酶与卵巢癌多药耐药关系研究的进一步计划

1.立题依据

2.研究内容

3.技术路线

4.本项目的特色与创新之处

5.研究的基础与可行性

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

二氢叶酸还原酶与卵巢上皮癌多药耐药关系的研究

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