稻秆降解复合菌系的筛选及其发酵特性研究

论文摘要

以秸秆为原料进行沼气发酵是推动产业沼气发展的重要途径,然而秸秆中的木质纤维素结构复杂、不易被微生物降解,严重制约了秸秆沼气的发展。木质纤维素的水解酸化是秸秆沼气发酵的限速步骤,如何实现木质纤维素的高效水解酸化一直是困扰研究学者的难题。关于木质纤维素降解菌的研究有很多报道,但多数存在酶系组成单一、纤维素降解率低、发酵温度要求过高的问题,不适合高寒地区沼气工程的运行。本研究从黑龙江省内富含腐草的多处特殊地理环境中取样,利用微生物之间天然形成的协同关系,在中温35℃条件下,筛选驯化能够高效降解木质纤维素的复合菌系,探讨其形态特征、生长特性、稻秆降解和产酸能力。主要研究内容和结果如下:1筛选构建木质纤维素降解复合菌系以稻秆为主要碳源,从富含纤维素的土壤中分离得到一组高效稳定降解稻秆的复合菌系LZF-12,经过四十多次的传代培养,该复合菌系的群落组成和降解性能趋于稳定。该复合菌系6天内即可将滤纸完全降解,7天即可软化稻秆。光学显微镜和扫描电镜显示LZF-12菌群组成比较复杂,从外观形态来看,粗细、长短不一,杆菌占主要的比例,其中夹杂着少量的球状菌、梭状菌和哑铃状菌等。2 LZF-12的生长特性研究通过测量分析LZF-12的生长曲线和DO曲线,发现该复合菌系由好氧菌株和微好氧菌株构成,好氧菌通过消耗培养基中的溶解氧为微好氧菌营造适宜环境,而木质纤维物质的降解主要依靠微好氧菌。不同初始pH值条件下,复合菌系发酵过程的环境pH值变化趋势基本一致,表明该菌系对环境的pH值具有较强的缓冲调节能力。3 LZF-12的发酵性能研究在监测稻秆被降解过程中的粗纤维变化时,发现复合菌系先利用稻秆中的半纤维素,然后开始降解纤维素,木质素在整个过程中被降解较少,到发酵结束时,稻秆总失重率为66%。液相末端产物VFAs（挥发酸）浓度在整个过程中先增大后减小,在第6天左右达到峰值,为3.44g/L,其中,乙酸与丁酸之和占到90%以上,丙酸含量较低,为下步的接甲烷菌产沼气反应提供了适当的底物。4碳氮比对LZF-12发酵过程的影响比较不同稻秆预处理方式对其降解的影响,结果显示1%氢氧化钠处理稻秆是一种经济有效的预处理方式。文中比较了五个碳氮比（即5:1,7:1,10:1,15:1,20:1）下发酵液中微生物浊度、pH值、稻秆降解率、VFAs变化,结果显示:碳氮比越低,培养基中氮源相对丰富,微生物量越大,稻秆的降解率也越大,相应的发酵产物VFAs产量也越高。因此,低的碳氮比利于复合菌系LZF-12降解稻秆产酸。5 DGGE监测发酵过程中群落动态DGGE分析显示,复合菌系LZF-12中微生物种类较多,优势菌群有Clostridium sp.、Uncultured Verrucomicrobia和Clostridium cellulolyticum。有资料显示这几类菌群具有较强的降解木质纤维素的能力,对于稻秆的降解起到了关键作用;此外,复合菌系中还含有Pseudomonas sp.、Acetivibrio sp.、Uncultured Acidithiobacillus sp.和Uncultured eubacterium等微生物种群,它们能发酵碳水化合物产生包括乙酸、丁酸、甲酸等的混合酸,形成了复合菌系以挥发酸为主要发酵产物的代谢途径。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 研究的目的及意义
• 1.2 农作物秸秆及化学组成
• 1.2.1 半纤维素
• 1.2.2 纤维素
• 1.2.3 木质素
• 1.3 微生物复合菌系协同降解木质纤维素的研究现状
• 1.3.1 分解木质纤维素的微生物
• 1.3.2 国内研究现状
• 1.3.3 国外研究现状
• 1.4 DGGE 技术在木质纤维素降解菌中的应用
• 1.4.1 DGGE 技术的原理及发展历程
• 1.4.2 DGGE 技术在木质纤维素生物降解研究中的应用
• 1.5 研究内容及方案
• 1.5.1 研究内容
• 1.5.2 研究方案
• 2 材料与方法
• 2.1 菌种富集与驯化
• 2.1.1 菌种来源
• 2.1.2 培养条件
• 2.2 测定指标与方法
• 2.2.1 光学显微镜观察
• 2.2.2 扫描电子显微镜观察
• 2.2.3 细胞浓度
• 2.2.4 pH 值的测定
• 2.2.5 稻草失重
• 2.2.6 纤维素、半纤维素、木质素含量的测定
• 2.2.7 挥发性脂肪酸的测定
• 2.2.8 氨态氮的测定
• 2.2.9 DNA 的提取
• 2.2.10 PCR 扩增
• 2.2.11 DGGE 电泳
• 2.2.12 DGGE 图谱目的条带的克隆测序
• 2.2.13 序列分析
• 2.3 试验主要仪器及药品试剂
• 2.3.1 试验主要仪器
• 2.3.2 试验药品试剂
• 3 筛选结果及发酵特性研究
• 3.1 复合菌系LZF-12 的筛选构建
• 3.2 复合菌系LZF-12 的形态观察
• 3.3 复合菌系LZF-12 生长特性研究
• 3.3.1 LZF-12 的生长曲线
• 3.3.2 发酵液的DO 值变化
• 3.3.3 不同初始pH 值对发酵体系内pH 变化的影响
• 3.4 复合菌系LZF-12 的降解特性观察
• 3.4.1 LZF-12 的滤纸降解特性
• 3.4.2 LZF-12 的稻秆降解特性
• 3.5 复合菌系LZF-12 的发酵特性研究
• 3.5.1 不同培养条件对复合菌系降解效果的影响
• 3.5.2 稻秆在复合菌系作用下的粗纤维变化
• 3.5.3 培养基氮源的变化情况
• 3.5.4 发酵过程中挥发酸变化
• 3.5.5 碳源负荷对发酵过程的影响
• 3.6 本章小结
• 4 稻秆预处理方式以及碳氮比对复合菌系降解稻秆的影响
• 4.1 不同预处理方式对复合系降解性能的影响
• 4.2 不同碳氮比下复合菌系的生长曲线
• 4.3 不同碳氮比下发酵液pH 的变化
• 4.4 不同碳氮比下稻秆失重变化
• 4.5 不同碳氮比对挥发酸产量的影响
• 4.6 本章小结
• 5 DGGE 电泳监测复合菌系 LZF-12 的群落结构
• 5.1 样品基因组DNA 的提取
• 5.2 发酵液样品 16SrRNA 的 PCR 扩增
• 5.3 PCR 扩增产物的DGGE 电泳
• 5.4 DGGE 图谱条带的序列比对
• 5.5 本章小结
• 6 结论与建议
• 6.1 主要结论
• 6.2 存在的问题及建议
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文