百合LLAG1和LLGLO1基因 ——功能分析及RNAi载体构建

论文摘要

百合为百合科百合属多年生球根类单子叶植物,因花姿优美,成为世界五大鲜切花之一,具有广泛的市场。长期以来,百合花形育种一直是人们关注的最重要的育种目标之一,人们希望获得具有更高观赏价值的花卉新品种,比如重瓣花,它具有的高贵丰满之美,促使人们在各种花卉中都希望获得重瓣的突变体。虽然有证据表明依据拟南芥、金鱼草等双子叶植物提出的ABC模型,并不完全适用于单子叶植物,但是仍然给人们在单子叶植物花发育相关基因的克隆和功能研究中提供了参考和借鉴。2004年荷兰的Beneditol等克隆了百合（L.longiflorum）的一个C类基因LLAG1,2006年本实验室成功克隆了百合（L.longiflorum）花发育中的B类功能基因LLGLO1。本研究的目的之一是进一步鉴定这两个花发育相关基因的功能,我们以麝香百合（L.longiflorum）的反转录cDNA为模板,克隆了LLGLO1及LLAG基因的全长cDNA片断,并连接到表达载体pBI121,转化烟草。由于时间批次的差异,目前只获得了40株LLGLO1-pBI121转基因烟草。转LLGLO1-pBI121的植株营养生长初期和开花时间与野生型没有明显差别,但植株高度较野生型矮,而且花瓣和雄蕊长度也较野生型短,而雌蕊的长度与野生型几乎没有差别,所以能明显的观察到转基因烟草柱头突出花瓣和花药0.1-0.4cm,另外转基因烟草的花药和柱头膨大,子房较野生型也明显膨大。这与RT-PCR检测到该基因在第一、二、三轮花器官中均有强烈表达和在成熟心皮中也有高表达的事实相符,但在转基因烟草花中未看到对萼片的影响。RNA干扰现象（RNAi）作为一种典型的转录后基因沉默（PTGS）调控方式,是一种古老、保守而又极其重要的外源核酸防御机制,广泛存在于生物界。RNAi技术就是人为的引入RNA干扰信号分子siRNA来沉默同源基因的表达。在烟草中验证两个基因功能的同时我们运用RNAi技术进一步研究LLGLO1和LLAG1基因的功能。通过LLGLO1和LLAG1的同源比较,分别选取3′-665-1144-5′、3′-662-874-5′和3′-450-718-5′、3′-431-803-5′特异片断作为LLAG1和LLGLO1的干扰序列,通过中间载体pSK+intron引入一段内含子间隔区,形成ihpRNA结构,连接到表达载体pCAMBIA1301中,成功构建了LLGLO1和LLAG1基因的ihpRNA干扰载体,并转入农杆菌EHA105中,用以下一步的转百合研究。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 植物花发育基因研究进展
• 1 成花诱导
• 1.1 环境外因及自身内因
• 1.2 相关基因的调控
• 2 花分生组织的形成
• 3 花器官形成
• 3.1 MADS-box 基因
• 3.2 ABC 模型
• 3.3 ABCD 模型
• 3.4 ABCDE 模型及四因子模型
• 4 百合MADS-BOX 基因的克隆
• 5 小结
• 第二章 植物基因功能研究方法
• 1 生物信息学在基因功能研究中的应用
• 1.1 基因功能初步发掘过程中生物信息学的应用
• 1.2 分子进化的研究
• 1.3 表达序列标签（expressed sequence tag, EST）
• 2 基因功能的转录和翻译水平的研究
• 2.1 基因表达系列分析
• 2.2 DNA 微阵列
• 3 从遗传学角度分析基因功能
• 3.1 基因诱变
• 3.2 基因功能敲除
• 3.3 基因超表达
• 3.4 RNA 干扰技术（RNA interfereing， RNAi）
• 4 展望
• 第三章 RNAi 技术在植物研究中的运用
• 1 RNAi 研究历史
• 2 RNA 沉默的的机理
• 3 RNAi 技术的要点和流程
• 3.1 实现RNA 沉默的方法
• 3.2 植物中常用的RNAi 载体
• 3.3 ihpRNA 中intron 片段的作用
• 4 RNAi 在植物研究中的应用
• 4.1 RNAi 是植物功能基因组学研究的有效工具
• 4.2 RNAi 作为作物改良和增产的有效工具
• 4.3 RNAi 用于植物病毒研究
• 5 小节
• 5.1 RNAi 技术与反义技术的区别
• 5.2 RNAi 技术的前景
• 第四章 百合花发育相关基因LLAG1 和LLGLO1 的功能分析
• 1 实验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌种及质粒
• 1.3 引物
• 2 实验方法
• 2.1 实验流程
• 2.2 总RNA 的提取
• 2.3 RNA 的检测
• 2.4 反转录
• 2.5 PCR 扩增LLAG1 和LLGLO1 cDNA 片断
• 2.6 目的片断的回收纯化
• 2.7 回收产物与T-Vecor 的连接
• 2.8 连接产物的转化
• 2.9 转化子的筛选和鉴定
• 2.10 序列测定和分析
• 2.11 表达载体的构建
• 2.12 农杆菌的转化
• 2.13 烟草的转化
• 2.14 转基因烟草的阳性检测和表型变异
• 3 结果分析
• 3.1 总RNA 的提取
• 3.2 反转录及基因cDNA 片断的扩增
• 3.3 T.vector-gene 的PCR 验证和酶切验证
• 3.4 测序分析
• 3.5 表达载体的构建
• 3.6 烟草转化
• 3.7 LLGLO1-pBI121 转基因烟草的PCR 检测及表型分析
• 4 讨论
• 第五章 百合LLAG1 和LLGLO1 基因的RNAI 载体构建
• 1 材料
• 2 实验方法
• 2.1 实验流程
• 2.2 总RNA 的提取等方法
• 2.3 ihpRNA 片断的克隆
• 2.4 RNAi 载体构建
• 3 结果分析
• 3.1 总RNA 的提取
• 3.2 质粒图
• 3.3 LLAGMLIKE-P1/P1 和LLGLO1-P1/P2 cDNA 片断的扩增
• 3.4 序列分析
• 3.5 RNA 干扰载体的PCR 及酶切验证
• 4 讨论
• 4.1 植物RNA 干扰载体中ihpRNA 片断的选择
• 4.2 ihpRNA 片断的获得
• 4.3 实验中的对照
• 4.4 RNAi 效应检测
• 5 下一步研究展望
• 参考文献
• 详细摘要